人工mir159介导番茄抗黄瓜花叶病毒遗传转化的研究

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1、浙江理工大学硕士学位论文摘要Micr0RNA(miI斟A)是一类长度在21～24nt、广泛存在于真核生物中的非编码小I斟A，它们通过与靶标mRNA的结合来发挥相应的负控调节等作用。m诹159是一类高度保守的miRNA，人们推测它可能存在于所有的陆地植物中。已有报道发现番茄中的m诹159在叶片中的本底表达量较高，但是它在番茄中的具体功能目前还是未知的。近年来关于小I埘A介导的基因沉默相关研究较为热门，相关研究显示虽然sil必A具有一定的基因沉默效应，但是由于其表达不够稳定、对靶标序列识别的专一性不足等缺点，其应用前景具有较大局限性和不确定性。黄瓜花叶病毒(C锄c姗16盯聊D

2、阳纪’7加fs，CMV)是较为典型的三分体正义单链(positivesinglestr锄dRN八+ssl斟A)病毒。它具有较为广泛的宿主，主要引起寄主花叶、矮化、绿岛、褪绿、黄化等症状，从而严重影响了植物的正常生长发育。番茄(句郴泐玎聊材跆船f姗lMill．)是人们日常生活中不可或缺的蔬菜型水果，提高其产量和品质的相关研究长期以来一直是热点。CMv作为引起的番茄病毒病的主要病因之一，每年造成的作物减产给经济发展和工农业生产带来了严重影响，因而研究与抗CMV相关的番茄遗传转化具有十分重要的科研价值和经济意义。本研究结合miRNA介导的基因沉默、番茄抗病毒相关的转基因等研究热

3、点，主要通过人工改造的m承159对番茄进行遗传转化，并在此过程中对各个操作条件进行优化，从而初步建立了人工m浓159介导的番茄抗黄瓜花叶病毒遗传转化体系。本文的主要内容分为三部分：一、通过对受体番茄MicroT0m的组培快繁及抗生素耐受性培养条件的筛选，确定了最适的分化外植体、培养条件以及分化、生根培养基配方，从而建立了MicroT0m遗传转化研究的基础。其中分化培养基配方为：MS+o．25mg／LIAA+2mg／L6一BA；生根培养基配方为：MS+o．5mg／LIBA；抗生素耐受性植株高效筛选浓度配比为：50mjg／L卡那霉素+200mg／L头孢霉素。二、构建含人工m浓

4、159前体(pre-am波159)的质粒pBIl2l一(pre-锄诹159)，再用该质粒分别转化农杆菌EHAl05和番茄Micr0Tom，筛得到抗性番茄再生植株若干，从而初步建立了番茄锄缺159介导的遗传转化体系。其中质粒的构建方法为：从CMV．Fny的RNAl上的ORf片段中筛选一段2lbp的序列作为锄浓159的靶标，根据此序列的互补片段设计出前体锄淑159序列，人工合成前体锄承159的cDNA序列后，再将此序列连接到质粒pBIl21上相应的位点。番茄的遗传转化过程主要为：通过用上述质粒转化的农杆菌侵染番茄外植体、在筛选性培养上筛选抗性再生植株等过程，初步筛选出抗性植株

5、。在此实验过程中同时研究并优化了外植体预处理方法、农杆菌侵染浓度、l浙江理工大学硕士学位论文农杆菌侵染时间等处理条件。三、通过对抗性番茄植株进行分子鉴定和相应的攻毒实验，得到转基因阳性植株抗CMv的综合数据，从而从抗CMV的功能性上验证了am诹159介导的番茄遗传转化体系的有效性。分子鉴定主要是通过PCR、Southem杂交方法鉴定抗性植株基因组DNA中的目的片段、RT-PCR方法鉴定抗性植株中目的RNA的表达情况，从而确定转基因阳性番茄。攻毒实验主要是对炼苗成功的转基因阳性番茄接种靶标病毒CMV-Fny，并于一定时间后进行抗病效果的检测。通过与未接病毒的番茄比较，发现转

6、基因阳性番茄对于靶标病毒CMV-Fny具有一定的抗性，主要表现在与普通番茄相比症状减轻或不感病、植株整体生长情况良好，等等。综合这三部分的研究成果，本文初步筛选并建立了番茄锄派159抗黄瓜花叶病毒的遗传转化体系。关键词：番茄；组培扩繁；人工miI斟A；黄瓜花叶病毒；遗传转化Ⅱ浙江理工大学硕士学位论文AbStraCtMicroRNAs(mil州As)are2l～24nucleotide(m)long，non-codillgsmallRNAsthatexistiIlahostaneukaryotes．Theyactbyb．mdillgt0theta唱etmRNAstonega

7、tiVelyregulategeneeXpression．M诹159isakindofhighlyconsen，edm很NAthatnlayexistiIlalmostalllandplams．Somestudies11aVealreadyshowedthatthequantityofm取159expressediIltomatoleavesisrehtivelyhigherthanotherm诖矾As，butitsf配tualmnctionilltomatoisStilluIll∞、Ⅳn．Inrecentlyyears，re