双价抗虫基因PtaCrylAc番茄的遗传转化研究

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1、农杆菌介导的双价抗虫基因Pta-CrylAc番茄的遗传转化研究摘要本研究优化了番茄的再生体系和农杆菌介导的番茄转化体系，并构建了应用于农杆菌介导法转化的双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta，以番茄品系Micro-Tom为材料进行了番茄转化、转化番茄的分子生物学鉴定以及遗传学分析，并初步进行了转基因番茄的抗虫鉴定工作，主要结果如下:1优化了农杆菌介导番茄转化的几个影响因素:①外植体长度在5。左右有利于愈伤组织的形成;②光照培养比暗培养更有利于愈伤组织的形成;③农杆菌侵染时间为8-10分钟:④菌液浓度OD6。约为0.15;⑤侵染液pH=5.2

2、;⑥乙酞丁香酮使用浓度为50umol/L;⑦共培养时间为三天时获得了最高的转化效率;⑧选用狡节青霉素为抑菌剂，浓度为300mg/l;⑨以PPT作为选择剂时的浓度为4mg/lo2以pCAMB工A3300为骨架，在此基础上构建了含半夏凝集素和苏云金芽抱杆菌的双价抗虫载体，并以根癌农杆菌LBAIIOO为侵染菌转化番茄。并且，转化后从325个外植体获得再生植株24株，再生率为8.5%.3对转化的24株再生植株中进行TPCR检测,RT-PCR检测以及Southernblot检测，并且确定阳性植株为15株，转化率为62.5%04对T工植株进行了抗虫基因众FZ刁。

3、分离分析，结果符合孟德尔规律，阳性和阴性之比为3;1:并且抗虫基因CryIA‘和抗虫基因尸艺a共分离。5对T,植株进行了除草剂抗性检测，抗除草剂有效成分PPT在20mg/la6对TI代植株BP-1^BP-7进行了小菜蛾幼虫初步抗性鉴定，抗虫性程度较为显著，但不同植株差异较大。关键词:番茄，CrylAc,Pta，根癌农杆菌，遗传转化，抗虫ThegenetictransformationofPta-CrylAcintomatovitaAgrobacterium-mediationAbstractAnefficientregenerationsystema

4、ndAgrobacterium-mediatedtransgenicsystemwasestablishedintomato.AplantexpressionvectorpCAMBIA3300-bt-ptaharboringtwoinsecticidalgeneswasconstructedandemployedinAgrobacterium-mediatedtomatotransformation.Themolecularassay,geneticsanalysisandinsect-resistancetestwereperformedsucce

5、ssfullytotarnsformedtomatovarietyMicro-Tom.Themajorresultssummarizedbellow:IAneficientandrapidAgrobacterium-mediatedtransformationprocedurehasbeenestablished:(!)Theexplantin5mm'longwasoptimalforcallusinduction.)Somel2hours'illuminationwassuitableforcallusinduction.(ITheoptimalt

6、imecourseforinoculationwas8-10minutes.(4I)OptimalconcentrationofagrobacteriaforinoculationwasODa,u=0.15⑥Acidicsolutionforinoculation(pH=5.2).⑥ConcentrationofASwas50umol/Lininoculationsolution.⑦Co-cultivationfor3days⑧Some300mg/ICarbencillinasinhibitorofagrobacteria.⑨Concentratio

7、nofPPTwas4m创Ifortheselection.2WeconstructedaplantexpressionvectorpCAMBIA3300-bt-ptaharboringtwoinsecticidalgenesptageneandbtgene,anduseditinAgrobacteriumLBA1100mediatedtomatotransformation.Weharvested24independentregeneratedpiantletsfrom325explants,andregenerativeratiowas8.5%su

8、ccessfully.3PCR,RTPCRandSouthernhybridizationanalysesc