流式细胞术检测在传染病诊断与治疗中的应用

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1、流式细胞术检测在传染病诊断与治疗中的应用一、流式细胞术概术流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪快速定量分析细胞等牛物粒子群体的理化、生物学特征以及根据这些特征精确分选细胞的新技术。它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利用此技术可对细胞大小、颗粒度、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等进行多参数相关检测与分析。流式细胞包括分析型流式型和分选型流式细胞仪两种。它的检测特性可对单个细胞或微粒进行分析、同时分析多种参数、检测速度快(1000

2、0个-20000个细胞/秒)、可提供细胞群体的均值和分布情况以及分选感兴趣的细胞或微粒。流式细胞术在20世纪60年代后期开始发展，主要用于生命科学的基础研究,尤其是免疫学、细胞生物学和分子生物学研究等。80年代后用于临床，主要用于监测HIV患者疾病的进展，开启了流式细胞仪用于临床的新纪元。随后通过分选干细胞过继回输用于疾病的治疗，开拓了应用范围。目前还应用于多种疾病的辅助诊断，尤其是白血病的诊断和分型。目前流式细胞仪的检测范围包括细胞结构与功能：细胞结构如细胞人小、颗粒度、表面面积、核浆比例、D

3、NA含量与细胞周期、RNA含量、蛋口质含量；细胞功能如细胞表面/胞浆/核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点及细胞受体等。二、工作原理流式细胞仪的基本结构主要由四部分组成。它们是流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统及计算机和分析系统。(1)流路系统：是由流动室和液流组成。流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射岀。鞘液的作用是将被检测

4、细胞限制在液流的轴线上，在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域，并保证每个细胞通过激光照射区的时间相同。分选型流式细胞仪的流动室上还装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。(2)光路系统：由激光光源、光束成型系统、多组透镜、滤光片等组成。检测信号包括散射光信号和荧光信号。散射光信号又包括前向角散射光(ForwardScatter,FSC)和侧向角散射光(90度散射光，SideScatter,SSC)。FSC与细胞的大小有关，SSC与细胞的颗粒度及细胞内相对复杂性有关。检测信号除包括散射光信号外，

5、还包括荧光信号。每种荧光染料均有特定的激发波长(EXCITING),被激发后会有发射波长(EMISSION),流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长。这些光学信号通过利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)，即亦可称之为特定的荧光通道来收集。通常将这些光学滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter),它包括允许长于设定波长的光通过的长通滤片(long-passfilter,LP)s允许短于设定波长的光通过的短通滤片(short-passfilter,SP)及允许一定带宽波长的光通过的带通滤

6、片(band-passfilter,BP)O这些滤片通常以45。角放置，该滤片可以通过一定波长的光，同时也可以阻断并折射该波长以下的光。这样可将不同波长的散色光和荧光信号区分开。（3）电路系统：由光电管和检测系统组成，作用是将光学信号转变为电脉冲（数字数据）信号。前向角散色光信号比较强，用光电二极管检测；侧向角散色光信号比较弱，用光电倍增管（PMT）接受放大；荧光也用PMT接受放大。散色光和荧光信号被接收后由电子系统补偿、调整，经模数转换成数字信号送计算机处理。（4）分析系统：经放大后的电信号被

7、送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模•数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。三、常见的流式细胞图检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量荧光强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，

8、既可以单独显示每个参数的肓方图，也可以选择二维的散点图、等高线图、灰度图或三维立体视图等。四、流式细胞仪检测工作流程溶血.消化单细胞悬液细胞理化特性分析图!荧光染料着色的样本激光激发盲细胞单列通过测量区分离、收集、分析光信号1•散射光信号2•荧光信号检测的细胞包括：培养的细胞、血液细胞（淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、网织红细胞）、实体组织（新鲜实体组织、石蜡包埋组织）、脱落细胞（宫颈、食管、胸腹水、內窥镜、冲洗液）等。样品制备注意事项：（1）待检细胞悬液内不能有粘集、团块，不能有过多的细