流式细胞术在肿瘤生物治疗中的应用xian

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1、流式细胞术在肿瘤生物治疗中的应用xian流式细胞术在肿瘤生物治疗屮的应川免疫系统所有有效应的成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作川。发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%,可分为T、B细胞、NK细胞、□噬细胞和树突状细胞。T淋巴细胞1.机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞进一步分化为辅助性T淋巴细胞(Th,CD3+CD4+T)和细胞毒性T淋巴细胞(Tc,CD3+CD8+T),2.Th细胞可分泌大量的细胞因子和辅助T细胞杀伤肿瘤细胞，而口具冇免疫记忆和直接杀伤肿瘤细胞的功能。3.Tc细胞是抗肿

2、瘤的主耍效应细胞，通过释放穿孔素及颗粒酶或促使细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞。4.Th和Tc细胞Z间的平衡是通过CD4+和CD8+细胞Z间的百分比表达出来的，比值下降表示免疫状态受抑制，正常人5.恶性肿瘤病人和健康人进行外周血FCM检测，肿瘤SICD3,CD4+/CD3+,CD4/CD8比值明显低于对照组，肿瘤组CD8十/CD3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病人的细胞免疫明显低下。NK细胞1.是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要作用。2.NK细胞代表

3、了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤纶氏的第一道防线，并通过T细胞补充特杲性抗肿瘤应答。3.在某种惠义上说，NK能强烈杀伤肿瘤细胞。4.体外介导杀伤大多肿瘤细胞的细胞亚群，90%以上是激活的NK细胞.5.NK细胞表面标志主要是CD16和CD56,其中CD16—般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟XK细胞表而，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作丿山其下降提示机体K细胞作川受抑制，细胞免疫功能下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞作用。6.恶性肿瘤病人NK细胞较对照组显著升高，但NK细胞活性是降低

4、的。CD4十CD25+Treg细胞1.是U前最新发现的一群具有强人免疫抑制作川的T细胞亚群，可能直接参与肿瘤的发生和发展过程。2.肿瘤患者的外周血和肿瘤局部比例增加。3.外周血调节T细胞比例的增加-与肿瘤的临床分期相关，恶性肿瘤患者免疫功能失调与肿瘤患者外周血调节Treg细胞比例増加有关。4.外周血CD4+CD25+Treg细胞水平可以捉示恶性肿瘤的预后，与低者相比，CD4+CD25+Treg细胞比例高者预后较差。曲于CD25作为活化指标，在大多数活化T细胞表而高表达，因此为进一步圈定Treg细胞，先后提

5、岀了Foxp3+和CD127—等较特异的表面标志，鉴于Foxp3作为转录因了，只在胞内表达，染色时需要破膜和固定，临床操作起來存在一定困难，近年來CD4CD25CD127-逐渐成为Treg细胞的主要检测标志而得到认町。十十DC1.在体内主要分为髓系mDC和淋巴系pDC两人类，是LI前已知功能最强的APC.是免疫反应的始动者和调节者，可高表达MHC分子、协同刺激分子和勃附分子，并能够刺激初始型T细胞增殖活化。2.在大多数肿瘤恵者体内可观察到外周血中两群DC数量减少和功能降低，且患者体内的DC数量与肿瘤的临床

6、分期及周围浸润呈负相关。经过生物治疗（CIK）后，患者外周血中两•群DC数量及百分比增加，功能增强，可提高机体的免疫功能，通过分泌细胞因子和呈递抗原，诱导针对肿瘤的特异性CTL,达到有效杀伤肿瘤细胞的冃的.二、流式细胞术标准化流程（推荐）（一）双色淋巴细胞亚群检测lOOuL抗凝全血（加至管底）20uL①MouseIgGl/IgG2a%1CD3/CD19,%1CD3/CD4,%1CD3/CD&%1CD3/CD16+CD56室温避光15—30min各加入2ml溶血素,室温避光10±2min300g离心5min

7、PBS洗涤2次,2ml/次,300g离心5minPBS,0.5ml,混匀，4°C避光,lh内上机或1%-2%多聚甲醛，4°C保存48h内上机FACS检测注意事项%1奔掉试管中上清液时，一怎保证一次性垂直倒掉，不能反复倾倒，防止细胞丢失；%1旷8°C保存，抗体试剂在保质期内稳定，不能冻存；抗体保存期间或与细胞孵育时注意避光;试剂瓶应保持于燥；%1任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用；%1为得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h内染色'%1操作时如未按指定的孵育时间、离心次数或

8、温度进行，容易发生错误；⑥抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错误结果。《二）四色淋巴细胞亚群检测1.取两支流式Tube,编号A和B,2在Tube小加人50ul充分混匀的抗凝全血。1.取20ulCD3/CD8/CD45/CD4抗体加人到A管中、取20川CD3/CD16+56/CD45/CD19标记的抗体加人B管中，涡旋混匀，室温避光放置15^-20mino4•取出加人450K11XFACS溶血素,充分混匀,