流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用.pdf

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1、JournalofChina-JapanFriendshipHospital2008Oc￡，Vo1．22，No．5中日友好医院学报2008年第22卷第5期303流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用张韫，靳耀英，李忻，杨鑫，高福云(中日友好医院临床医学研究所中心实验室．北京100029)中图分类号：R318．6文献标识码：A文章编号：1001—0025(2008)05—0303—03流式细胞仪(flowcvtometer．FCM)是一项集激光、电1．2．1散射光信号子物理、，匕电测量、计算机、细胞荧光化学以及单克隆抗体散射光分为

2、前向角散射_}匕(forwardscatter，FSC)和侧技术为一体的新型高科技仪器它町对单细胞或其他生物向角散射光(sidescatter，SSC)．散射光不依赖任何细胞样颗粒膜表面以及内部的化学成分进行快速定量分析与分品的制备技术．L夭】此被称为细胞的有参数。FSC与被测选。随着现代技术的发展使其在分子生物学、免疫学、遗传细胞的大小有关SSC与细胞内颗粒多少有父．对细胞内学、临床医学、药学等领域If1的应用有了突飞猛进的发展，的折射率更为敏感．可提供有关细胞内精细结构和颗粒性在临床医学和科研11发挥着越来越重要的作用

3、⋯质的信息在Apo时，细胞固缩、体积变小，故FSC降低，细胞凋亡二(apoptosis．Apo)又称细胞程序性死亡此外Apo时由于染色体降解，核破裂彤成，细胞内颗粒往(programmedcelldeath．PCD)．是指细胞在一定生理或病往增多．故凋细胞SSC常增加这正是流式细胞仪榆测理条件下．遵循自身的程序．通过自我调控结束自己生命Ap0的主要特性之一的过程[21。Apo是一个主动的、高度有序的、基冈控制的、一1．2．2荧光信号系列酶参与的过程。它被认为是维持机体内环境稳定．清当激光光束与细胞正交时．一般会产生两种荧圯

4、信除衰老和无能细胞的重要机制【3j凋亡细胞的形态、酶、线号一种是细胞自身在激光照射下发出微弱荧光信号．称粒体膜电位、DNA结构、DNA含量等都会在Apo过程中有为细胞自发荧光：另一一种是经过特异荧光素标记细胞后．所变化进行ADo的检测不仅对基础理论研究有重要意受激光照射得到的荧光信号．通过对这类荧光信号的检测义．x~rl$床疾病的诊断和预后判断也有指导意义本文就与定量分析，就能对所研究的细胞进行定性和定量测定。应J【=}j流式细胞仪检测Apo的常用方法简单综述如下．根据凋亡细胞的形态、酶、线粒体膜电位、DNA结构、DNA含

5、量等变化．运用与之相对应的特异荧光素标记．并对此1原理进行FCM检测，可将活细胞、早／中期凋亡细胞、坏死细胞1．1流式细胞仪的_．厂作原理或晚期凋r_细胞区分开t6]FCM的结构一般分为5部分：①流动窀及液流驱动系统；②激光)匕源及成形系统；③光学系统：④信号检测、2流式细胞仪常用的Apo检测方法存、显示、分析系统；⑤细胞分选系统lll。经荧光染料标记2．1半胱氨酸蛋门酶一3法l7‘91过的细胞样品制成单细胞悬液．以一定的流速经过喷嘴．半胱氨酸蛋白一3fcaspase-3)是凋亡程序[fJ重要的流速的选择与检测的目的有关液

6、流经过光源发出激光形caspase酶，在Apo早期就已经活化，是Apo早期的检测指成的聚焦区．标记的荧光染料在激发光的激发下发射出特标Caspase一3的激活意味着细胞不可避免的发生凋亡．因异颜色的散射光信号和荧光信号．信号的强弱与细胞内待而Caspase一3活性的检测可为Apo发生提供最直接的证测组分的含量呈正比荧光信号和散射光信号经过光电倍据caspases一3的活性在Apo发生前是测不到的只有在增管和光电探测器接收后转换成电脉冲．送人计算机处凋亡早期才能检测到．随后在凋亡的过程中持续升高．存理，应用不同的分析软件可分

7、析样品的各种参数．最后以凋亡晚期快速下降例如．细胞角蛋白尤其是细胞角蛋白直方图或二维图的形式显示Ⅲ来．还可以用不同的荧光标18(cytokeratin18，CK18)，是在ApO的极早期被Caspase一3记物进行单参数、双参数、甚至多参数的分析。等切割的一种蛋白质单克隆抗体M3OCytoDeath能特异1．2流式细胞仪的检测原理性识别CK18内的一个caspases切割位点．这在正常细胞当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时．受激是检测不到的．通过对此抗原一抗体进行荧光标记．可用光激发产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧

8、光信号FCM对早早期Apo进行检测这些信号以细胞为中心．向空问360~角立体发射．产生散2．2磷脂结合蛋白AnnexinV—FITC／PI法射光信号和荧光信号正常细胞膜磷脂的分布是不对称的．膜内表面含负电的磷脂，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine．PS)，而膜作者简介：张韫(1982一