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《不同抗螨性能东方蜜蜂obp3基因的克隆与表达变化规律的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、AnhuiAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationAnalysisonCloningandRulesofExpressionChangesofobp3ofApisCeranaFabriciuswithDifferentmiteResistingPropertyPostgraduateYangChenTutorProf.Lin-ShengYuSpeciality:AnimalGeneticBreedingandReproductionDirection:ProtectionandUtilizationofGeneti
2、cResourcesJune,2013Hefei,Anhui,P.R.China摘要本文旨在分析不同抗螨特性的东方蜜蜂的obp3基因的全序列的差异以及obp3基因在不同抗螨性能东方蜜蜂中时空表达变化规律，以寻找obp3基因与蜜蜂抗螨性能的相关性，并制备东方蜜蜂OBP3多克隆抗体，为后续研究提供材料。1.根据NCBI数据库中西方蜜蜂（ApismelliferaL.）obp3（odorantbindingprotein3）基因的cDNA序列设计引物，以东方蜜蜂cDNA为模板克隆并测序获得obp3cDNA基因全序列。结果显示，东方蜜蜂蜂螨易感组和抗螨组除在192位点存在c
3、/t（L/F）的有义突变外,在164位点存在a/g，200位点存在g/a，341位点存在g/a的无义突变；西方蜜蜂与东方蜜蜂螨组相比，前者在51-53位点存在三个碱基cag的缺失使得其编码的氨基酸缺少一个谷氨酰胺（Q），在159，161,201,217,231,234,235,318,321,348,364,367,372,374,452位点存在着a/c(I/L),a/g(I/L),a/t(M/L),g/a(G/D),a/g(M/V),c/t(Q/S),a/c(Q/S),a/g(N/D),g/a(D/N),g/a(V/T),c/g(T/S),a/g(K/R),c/g
4、(L/V),t/c(L/V),a/c(R/S)的有义突变,体现了两者在物种上的差别。2.对不同抗螨性能东方蜜蜂obp3基因进行荧光定量PCR检测，结果表明obp3基因在抗螨组腹部与头部表达量最高，同时与螨易感组在头部与腹部的表达量差异显著，对东方蜜蜂螨易感组不同日龄obp3基因表达量的荧光定量PCR检测结果表明，抗螨组的东方蜜蜂obp3基因在头部与腹部的表达量大体趋势是随日龄增长而增加。东方蜜蜂obp3基因全序列测序结果与时空表达变化研究结果共同表明，抗螨组东方蜜蜂的obp3基因与螨易感组东方蜜蜂的obp3基因不仅在序列上有碱基突变导致的蛋白质变异，并且在obp3基
5、因表达量上差异也很明显，这两点共同说明了obp3基因对东方蜜蜂抗螨性能有影响。3.生物信息学分析结果显示OBP3蛋白共有148个氨基酸，分子式为C766H1221N205O235S16，分子量为17575.3，理论等电点为4.94，估计半衰期为30h。OBP3蛋白属于不稳定蛋白，不稳定指数为40.94，脂肪指数为89.53，亲水指数为-0.311。OBP3蛋白没有卷曲螺旋结构，没有跨膜区。OBP3蛋白疏水性指数最大值为3.244，最小值为-2.944。OBP3蛋白属于全α型蛋白。OBP3蛋白的信号肽具体序列为MKTIVILLFTLCIVSYMQMVRCD，剪切位点位
6、于第22-23位氨基酸。OBP3蛋白定位于分泌通路。4.本实验成功构建pET-OBP3原核表达载体，重组子pET-OBP3经酶切鉴定及测序，电泳结果表明酶切可以切出与obp3基因片段长度相等的片段，测序结果表明序列正确。将重组质粒pET-OBP3转化入大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)中进行表达，用其表达的蛋白作为抗原免疫新西兰大耳兔，获得兔抗蜜蜂OBP3抗血清，经Iwestern-blot分析可见兔抗蜜蜂OBP3抗血清与pET-OBP3抗原发生特异性结合，表明obp3基因已在E.coli中获得表达。东方蜜蜂obp3基因多克隆抗体制备成功。关键词：东方
7、蜜蜂；obp3基因；序列分析；生物信息学分析；原核表达载体；多克隆抗体IIAbstractThisassayisaimingatanalyzingthedifferenceofthewholesequenceofobp3(odorantbindingprotein3)betweenvarroa-resistantandnon-varroa-resistantApiscerana,andsearchingforitstemporalandspatialexpressionpatternsbet-weenthetwohoneybeesamples,tofindthe
