屋尘螨抗原Derp2基因的克隆和表达

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1、屋尘螨抗原Derp2基因的克隆和表达作者：史皆然　李元　戚好文　李别虎　柏银兰　范雄林　薛莹【关键词】尘螨抗原关键词:尘螨抗原;基因;克隆;表达摘要:目的构建并克隆屋尘螨抗原Derp2基因，在大肠杆菌中初步表达.方法根据已发表的Derp2基因，人工设计合成一系列基因片段，经单链扩增后连接成完整的Derp2基因;将该基因克隆入表达载体pProEXHTb中，测序并进行初步表达.结果利用所设计的结构制备了完整的Derp2基因，以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得初步表达，该外源蛋白Mr约为17×103，占总蛋白量的20%.结论所构建的Derp2基因能在大肠杆菌中表达.　　

2、Keywords:dustmiteantigen;gene;cloning;expression　　Abstract:AIMToconstructandclonethegeneofthehousedustmiteantigenDerp2，whichisexpressedinE.coli.METHODSThegenefragmentsweredesignedandsynthesizedbythepublishedhousedustmiteantigenDerp2.UsingsinglechainamplificationbyPCRandT4ligase，weprepar

3、edthewholeDerp2gene，whichwasclonedtoexpressvectorpProEXHTbforsequenceanalysisandexpression.RESULTSThewholeDerp2gene10wasconstructedwith　designedstructureandexpressedbyIPTGinducementinE.coli.TheDerp2proteinwasdetectedtobeaboutMr17×103bySDS-PAGE.Theyieldaccountforupto20%ofthetotalamountof

4、protein.CONCLUSIONTheconstructedDerp2genecanbeexpressedinE.coli.　　0引言　　屋尘螨（housedustmite，HDM）抗原是一种重要的空气变应原，在临床上引起哮喘、皮炎等多种超敏反应性疾病［1］.Derp2是屋尘螨抗原中的重要成分，最早从学名为Dermatophagoidespteronyssinus的螨虫体内分离，编码Derp2的cDNA于1990年克隆［2］.现已证实Derp2的一些表位为小鼠和人类T细胞所识别.将Derp2基因转入卡介苗（bacilluscalmette-guerin，BCG）中

5、，制备抗原肽基因重组BCG疫苗，有可能成为预防哮喘等过敏性疾病的新途径.为此，我们采用基因分段合成连接的方法，构建了完整的Derp2基因，并进行了初步表达.　　1材料和方法　　1.1材料限制性内切酶，X-gal，IPTG，dNTP，pMD18-TVector，DNAMarkerDL2000购自Takara公司;Taq10DNA聚合酶，pGEM-T-easyVec-torKit为Promega公司产品;表达载体pProEXHTb、凝胶DNA纯化Kit，PfxDNA扩增Kit为Gibco公司产品;RNaseA购自华美公司;WesternBlotKit为Boehringer

6、Mannheim公司产品;硝酸纤维素滤膜为美国Schlcher&Schuell公司产品;HRP标记羊抗鼠Ig抗体为kako公司产品;鼠抗His6mAbNo.1抗体为第四军医大学基础部免疫学教研室张新海博士惠赠.其余试剂为国产分析纯或分子生物学专用试剂.E.coliDH5α由本实验室保存.　　1.2方法　　1.2.1Derp2基因片段的设计、合成及序列测定将全长387bp的Derp2基因分成11个片段（Fig1），F1和R1为Derp2基因的引物，含有BamHI和HindIII位点;F3，F5，R4，R6为大片段;R3，R5，F4，F6为小片段，5’端磷酸化，分

7、别与F3，F5，R4，R6互补;R2为连接F1与F3间的补丁;R7为连接R6与R1间的补丁;在片段3和4以及片段5和6之间设计成4个碱基互补的粘端，在（1～2）和（3～4）、（3～4）和（5～6）之间设计有SmaI和ClaI位点作为片段间连接之用.各单链基因片段由北京赛百盛公司合成.DNA序列由上海基康公司测定.　　图1略　　1.2.2Derp2基因的连接10设立5个体系分别以R2，F3，R4，F5，R6为模板，以F1，R3，F4，R5，F6为引物行片段（1～2），3，4，5和6的单链扩增:在50μL反应体系中，加入10×PCR缓冲液5μL，TaqD