屋尘螨抗原der p2基因的克隆和表达

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1、屋尘螨抗原Derp2基因的克隆和表达摘要:目的构建并克隆屋尘螨抗原Derp2基因，在大肠杆菌中初步表达.方法根据已发表的Derp2基因，人工设计合成一系列基因片段，经单链扩增后连接成完整的Derp2基因;将该基因克隆入表达载体pProEXHTb中，测序并进行初步表达.结果利用所设计的结构制备了完整的Derp2基因，以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得初步表达，该外源蛋白Mr约为17×103，占总蛋白量的20%.结论所构建的Derp2基因能在大肠杆菌中表达.　　Keyiteantigen;gene;cloning;expression　　Abs

2、tract:AIMToconstructandclonethegeneofthehousedustmiteantigenDerp2，entsiteantigenDerp2.UsingsinglechainamplificationbyPCRandT4ligase，entinE.coli.TheDerp2proteinountofprotein.CONCLUSIONTheconstructedDerp2genecanbeexpressedinE.coli.　　0引言　　屋尘螨（housedustmite，HDM）抗原是一种重要的空气变应原，在临床

3、上引起哮喘、皮炎等多种超敏反应性疾病［1］.Derp2是屋尘螨抗原中的重要成分，最早从学名为Dermatophagoidespteronyssinus的螨虫体内分离，编码Derp2的cDNA于1990年克隆［2］.现已证实Derp2的一些表位为小鼠和人类T细胞所识别.将Derp2基因转入卡介苗（bacilluscalmette-guerin，BCG）中，制备抗原肽基因重组BCG疫苗，有可能成为预防哮喘等过敏性疾病的新途径.为此，我们采用基因分段合成连接的方法，构建了完整的Derp2基因，并进行了初步表达.　　1材料和方法　　1.1材料限制性内切

4、酶，X-gal，IPTG，dNTP，pMD18-TVector，DNAMarkerDL2000购自Takara公司;TaqDNA聚合酶，pGEM-T-easyVec-torKit为Promega公司产品;表达载体pProEXHTb、凝胶DNA纯化Kit，PfxDNA扩增Kit为Gibco公司产品;RNaseA购自华美公司;annheim公司产品;硝酸纤维素滤膜为美国SchlcherSchuell公司产品;HRP标记羊抗鼠Ig抗体为kako公司产品;鼠抗His6mAbNo.1抗体为第四军医大学基础部免疫学教研室张新海博士惠赠.其余试剂为国产分析纯

5、或分子生物学专用试剂.E.coliDH5α由本实验室保存.　　1.2方法　　1.2.1Derp2基因片段的设计、合成及序列测定将全长387bp的Derp2基因分成11个片段（Fig1），F1和R1为Derp2基因的引物，含有BamHI和HindIII位点;F3，F5，R4，R6为大片段;R3，R5，F4，F6为小片段，5’端磷酸化，分别与F3，F5，R4，R6互补;R2为连接F1与F3间的补丁;R7为连接R6与R1间的补丁;在片段3和4以及片段5和6之间设计成4个碱基互补的粘端，在（1～2）和（3～4）、（3～4）和（5～6）之间设计有SmaI

6、和ClaI位点作为片段间连接之用.各单链基因片段由北京赛百盛公司合成.DNA序列由上海基康公司测定.　　图1略　　1.2.2Derp2基因的连接设立5个体系分别以R2，F3，R4，F5，R6为模板，以F1，R3，F4，R5，F6为引物行片段（1～2），3，4，5和6的单链扩增:在50μL反应体系中，加入10×PCR缓冲液5μL，TaqDNA聚合酶1μL（83nkat），dNTP5μL（2.5mmol・L-1），大、小片段各1μL（10μmol・L-1），混匀，置94℃变性30s后，进行循环反应.参数为:94℃30s，

7、58℃30s，72℃20s，共15个循环，末次循环结束后72℃保温30min.PCR产物用30g・L-1琼脂糖凝胶电泳观察，回收DNA条带，按说明用Gibco公司的凝胶DNA纯化试剂盒纯化扩增产物.按Fig2所示流程，片段3和4，5和6分别用T4DNA连接酶催化，于4℃连接过夜，将连接产物（3～4），（5～6）与pGEM-T-easy载体片段、（1～2）与pMDT18载体按3∶1的浓度比例，在T4DNA连接酶催化下，于室温连接2h，转化用低温CaCl2制备的E.coliDH5α感受态细胞，涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg&#

8、12539;L-1），经IPTG诱导，通过X-gal显色筛选白色菌斑.　　随机挑选6个白色菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB中，37℃振荡培养过