外源mmu-mir-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究

《外源mmu-mir-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究学校代码：10255学号：2110423硕士学位论文MASTERTHESIS外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究EXOGENOUSMMU-MIR-505OFEXPRESSIONANDFUNCTIONINMAMMALIANCELLS学科专业生物化学与分子生物学作者马骁骁指导教师周宇荀副教授答辩日期2014年2月万方数据外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究东华大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的

2、成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日万方数据外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究东华大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密

3、后适用本版权书。本学位论文属于不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年万方数据外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究摘要目的：miRNA是一类长约22nt具有调节功能的保守的非编码小RNA，在调控发育时序，细胞增殖与凋亡以及肿瘤发生中起着重要的作用。同时miRNA也参与了神经细胞的自我更新、脊椎动物的发育、心脏、肌肉以及神经系统的形成等多种生物学过程和信号通路。哺乳动物的雷帕霉素靶(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有

4、多种生物学功能，与蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢、细胞凋亡及自噬等均有联系。通过查阅文献我们发现miRNA-505也许通过影响ASF/SF2的表达，而参与调控mTOR通路。为了进一步研究miRNA-505的生物学功能，我们分别利用质粒pcDNA™6.2、慢病毒载体FUGW及Fsy，构建了在哺乳动物细胞中表达miRNA-505-3p，-5p的载体，它们分别受到病毒来源启动子CMV（巨细胞病毒）、哺乳动物细胞内源性启动子UBC（泛素酶）及神经元特异性启动子Syn（突触蛋白I）调控，以获得具有不同表达效率及组织特异性的载体。脂质体法将重组质粒转染至原代培养的神经元细胞与HEK293T等细

5、胞系中，检测细胞中miRNA-505的表达量与相关蛋白ASF/SF2的变化。方法：将miR-505-3p与miR-505-5p成熟体分别构建成shＲＮＡI万方数据外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究形式，装入pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR表达载体中，采用PCR方法从pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR-505-3p，5p表达载体质粒扩增出miR-505-3p/5pshRNA基因编码区173bp、175bp片段，通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接，分别将miR-505-3p，5pshRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与Fsy中，构建成重组

6、载体FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p。在脂质体介导下将构建成功的慢病毒载体转染至原代培养的神经元细胞和HEK293T等细胞系，荧光显微镜下观测EGFP的表达，流式细胞仪监测转染效率，RT-PCR方法检测细胞中miR-505的表达量。westernblot方法检测细胞中相关蛋白ASF/SF2的变化。结果：1、成功构建带有miRNA-505shRNA基因片段的四种慢病毒载体FUGW-miR-505-3p，FUGW-miR-505-5p，Fsy-miR-505-3p和Fsy-miR-505-5p。2、荧光显微镜下观察到，慢病毒载体Fsy-miR-50

7、5转染的原代培养的神经元中EGFP荧光强度较高；HEK293T细胞系中，重组质粒总体转染效率较高，FUGW-miR-505转染的细胞EGFP荧光强度最高，Fsy-miR-505转染的细胞EGFP荧光强度最弱。3、实时荧光定量PCR结果显示，转染pcDNA-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p与Fsy-miR-505-3p的细胞中miR-505-3p增多;转染pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p与Fsy-miR-5