sarscov刺突蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及功能分析

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1、中国医学科学院中国协和医科人学硕上研究生毕业论文图表目录图1S基因及其片段插入表达载体后酶切鉴定结果的DNA电泳图43图2用WesternBlotting的方法确定S融合蛋白及其片段在宿主细胞中正确表达45图3纯化后的融合蛋白S1190Fe聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色的结果．，46图4融合蛋白S1190Fc在4"C结合VeroE6细胞的流式结果47图5融合蛋白S1190Fc与转染了hACE2的293E细胞结合的流式结果．47图6融合蛋白S1190Fc与转染了mACE2的293E细胞结合的流式结果48图7S11

2、90Fc与ACE2受体的免疫共沉淀(IP)的结果59图8用培养细胞做ACE2受体下调实验的结果60图9用培养细胞做ACE2受体下调实验的结果6l图10细胞融合实验。62图1l野生型小鼠肺部酸或盐吸入并加注融合蛋白S1190Fc的肺弹回率变化63图12野生型小鼠肺部酸或盐吸入加注融合蛋白S1190Fc或$318—510Fc肺弹回率变化．．64图13小鼠肺组织病理切片．．65图14检测融合蛋白S1190Fc的肺免疫组化结果67图15肺组织ACE2蛋白表达量下降．68图16用SpeI和HindⅢ酶切质粒构建前后的凝胶

3、电泳图93图17用AvrII酶切质粒并回收后的DNA凝胶电泳圈94图18筛选出的第一株细胞加入不同浓度的ATRA后的细胞绿色荧光的变化96图19筛选出的第二株细胞加入不同浓度的ATRA后的细胞绿色荧光的变化96图20筛选出的细胞株加入ATRA前后的荧光变化照片97图2I细胞株A的剂量效应曲线100图22回归直线及回归方程101图23加入萃取液72h后的可见光与绿色荧光照片．102图24筛选出的阳性化合物的可见光与绿色荧光照片104图25药物筛选细胞模型的可见光与绿色荧光照片110图26药筛模型的剂量效应曲线11

4、2图27回归直线及回归方程．．112图28PMA刺激细胞72小时后，细胞绿色荧光的变化113图29PAMAMG5刺激细胞72小时后，细胞绿色荧光的变化113图30PAMAMG7刺激细胞72小时后，细胞绿色荧光的变化114图31PAMAMG9刺激细胞72小时后，细胞绿色荧光的变化114图32PAMAMG3刺激细胞5天后，细胞状态的变化．．115图33PAMAMG3肌肉注射后肝脏的病理改变(200x)一6图34PAMAMG3肌肉注射后肝脏的病理改变(200x)一6图35PAMAMG3肌肉注射后肝脏的病理改变(400

5、x)．．7图36PAMAMG3肌肉注射后肾脏的病理改变(400x)～8图37PAMAMG3肌肉注射后肾脏的病理改变(400x)．．8图39PAMAMG3肌肉注射后小肠的病理改变(400x)．．；}19图38PAMAMG3肌肉注射后小肠的病理改变(100x)．．9．7．中国医学科学院中国协和医科人学硕士研究生毕业论文图40PAMAMG3肌肉注射后注射部位的退行性病变(200×)120图41PAMAMG3肌肉注射后注射部位的退行性改变(400×)121表1人体高表达基因中密码子使用频率比例表2肺损伤评分结果．．表3

6、每孔的三个随机读数及均值表4三个平行样品均值及标准差表5线性范围内的ATRA的浓度及读数均值表6三个平行样品读数均值及标准差珈局册啪mⅢ中国医学科学院中国协和医科大学碗上研究生毕业论文中文摘要SARS．CoV刺突蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及功能研究论文摘要：导致严重急性呼吸综合征(SARS)世界性爆发流行的病原体是一种新型的冠状病毒SARS冠状病毒(sARs—CoV)。SARS是一种以呼吸系统症状为主要表现的全身性疾病，可引起全身多器官多组织损伤，导致患者死亡的主要病因为急性呼吸窘迫综合征(A

7、RDs)。其宿主范围广，传播速度快，且可通过飞沫甚至空气传播，危害极大。现有研究证实，SARS．CoV的刺突蛋白(Spikeprotein，S蛋白)是病毒表面的最重要的膜蛋白，能够与受体结合并促进病毒入胞，并且是诱发机体免疫系统产生中和抗体的主要抗原蛋白。但由于s蛋白存在大量的翻译后修饰位点，主要是糖基化位点，致使通过原核细胞表达或酵母表达的蛋白将不能正确地折叠，影响其生物活性。只有在哺乳动物细胞系统中进行表达，S蛋白才能进行正确地修饰，折叠和加工处理，从而保持蛋白的活性。但在哺乳动物细胞系统中表达SARS．C

8、oV编码的S蛋白又存在表达量低的特点，难以在实际中应用。因此，本论文通过一系列的优化与实验，将全长的S蛋白及其不同的片段在哺乳动物细胞系统中进行了高量表达及纯化。并进一步研究了s蛋自在体内的生物学作用。本论文的一系列的实验结果证明S蛋白能够结合宿主细胞受体，并引起受体下调，从而造成或加剧急性肺损伤，从分子水平上解释了SARS是如何导致急性呼吸窘迫综合征的致病机理。本论文还进一步验证了S