重组腺病毒介导哺乳动物细胞高效分泌表达外源蛋白

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文重组腺病毒介导哺乳动物细胞高效分泌表达外源蛋白Hi曲SecretiVeEXpressionofforeigllProteiIli11M锄maliancellsMediatedbyRecombinantAdenoVims课题来源：病原微生物生物安全国家重点实验室项目(项目编号：2011A090200071)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员揭飞龙李红卫病理学与病理生理学学术型硕士研究生生物技术学院张雁惠宏襄教授王剑英高级工程师胡志明教授李妍副教授2014年5月1

2、O日广州硕士学位论文m㈣⋯m删⋯m㈣删Ⅲ㈣IY2617981重组腺病毒介导哺乳动物细胞高效分泌表达外源蛋白硕士研究生：揭飞龙指导教师：李红卫摘要基因是生物机体遗传信息的储存、复制和表达的携带者，蛋白质是机体生命活动的执行者和体现者。进入后基因组时代，生命科学研究仅仅停留在核酸层面是远远不够的。虽然蛋白质的一级结构，即氨基酸的数量、种类及排列顺序，是蛋白质结构和功能的基础，由基因的核酸序列决定。不过蛋白质的结构是非常复杂和不规则的，目前的理论知识仍然无法完全正确的预测蛋白质的复杂结构与功能，比如如何从其氨基酸序列折叠形成三维结构的蛋白质仍

3、然是未知的。如果要对一个基因进行研究，首先必须通过重组蛋白表达系统获得足够量的目的蛋白，才能对该蛋白进行后续研究。因此，蛋白质是科学研究的原材料，重组蛋白表达系统是生命科学研究的助推器。重组蛋白表达系统主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统，其中每个系统有其各自的特点，目前应用比较广泛的是大肠杆菌表达系统。每个重组蛋白表达系统的特点分述如下：大肠菌表达系统的优点是遗传背景研究清楚，操作方便，生产成本低，重组蛋白表达量高；缺点是缺乏糖基化等蛋白修饰功能，无法生产表达结构复杂的外源蛋白，重组蛋白多数无

4、法形成正确的折叠，常以不溶性包涵体的形式表达，需要体外再折叠来恢复活性。酵母表达系统兼有原核生物和真核生物的特点，可以迅速生长，正确加工修饰重组蛋白，重组蛋白表达量高；缺点是具有密码子偏向性，对外源基因的序列有特定要求，无法加工修饰结构非常复杂的外源蛋白。中文摘要昆虫细胞表达系统(比如杆状病毒介导)优点是生产表达量相对较高，具有比较完善的翻译后加工修饰功能。不过其糖基化的寡糖链与哺乳动物细胞表达的不一样，并且无法识别裂解很多蛋白前体。哺乳动物细胞表达系统具有非常完善的糖基化修饰功能、折叠机制，可以理想地翻译后加工、修饰、分泌重组蛋白。目

5、前存在问题是表达量低、基因表达调控复杂、下游纯化相对困难等。外源蛋白的有效表达需要选择合适的表达系统，必须考虑蛋白结构复杂程度、实验要求、技术条件等因素。哺乳动物细胞表达系统虽然外源基因表达量低，却可以正确表达结构非常复杂的外源蛋白，使重组蛋白的结构接近其天然结构。比如，哺乳动物细胞表达的抗原蛋白具有良好的免疫原性从而提高免疫诊断准确率。因此，哺乳动物细胞表达系统是目前发展的主流方向。有两种方法可以介导外源基因进入细胞：一种是病毒感染介导，比如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等；一种是采用化学方法(比如脂质体、磷酸钙、PEI等)或

6、者物理方法(例如显微注射、电穿孔等)直接将DNA导入细胞。腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组长约25—45kb，理论上可编码22—40个基因，衣壳呈规则的20面体结构，直径80—110nm。腺病毒载体系统广泛用于人类蛋白和非人类蛋白的表达，具有宿主范围广、可以感染一系列动物细胞，对人致病性低，可在增值细胞和非增值细胞感染表达，不整合到细胞基因组、无基因突变与致癌风险等优点。同时腺病毒可以编码表达多个外源基因，以及腺病毒可以在特定细胞高效扩增，容易获得高滴度(1012PFU／m1)的腺病毒，这使得腺病毒非常适合基因治疗和体内接种疫

7、苗。高效的真核分泌表达系统主要包括两部分：高效分泌表达系统和宿主细胞。为了构建高效分泌表达的腺病毒载体，引导重组蛋白高效率分泌到培养上清，方便于重组蛋白的纯化。本研究在两方面对外源基因在动物细胞表达的影响进行探索性研究，比如信号肽置换与无血清培养。首先我们尝试用信号肽置换提高人凝血因子FV工I(FVI工)的分泌表达效率。II硕士学位论文FVI工在内、外源性止血途径中起着重要作用，在临床应用具有极大的价值。而人FVll分泌表达效率很低，虽然FVII的研究已经持续了几十年，却一直没有明显提高FVII的表达量。本研究尝试用小鼠抗体Kappa轻

8、链信号肽(IgK)、人干扰素IFN—Q信号肽(IFN—Q)、人干扰素IFN一丫信号肽(IFN一丫)、小鼠骨形成蛋白BMP6信号肽(BMP6)、小鼠组织纤溶酶原激活物tPA信号肽(tPA)置换信号肽，构建FV