神经源性分化蛋白neurod在胰腺癌中的表达及功能研究

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1、第二军医大学博士学位论文神经源性分化蛋白NeuroD在胰腺癌中的表达及功能研究姓名：王洋申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：朱明华20120518摘要神经源性分化蛋白NeuroD在胰腺癌中的表达及功能研究目的：探讨神经源性分化蛋I兰t(neurogenicdifferentiation，NeuroD)在胰腺癌发生发展中的作用。方法：1、应用组织芯片和免疫组化法研究NeuroD、增殖细胞核抗原(PCNA)、p53在127例胰腺癌中的表达情况，并光镜下观察胰腺癌神经组织浸润、神经周围淋巴细胞套、癌旁慢性胰腺炎、胰周淋巴结转移情况。分析NeuroD的表达与上述指标及性

2、别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型及分化程度等的关系。2、根据已公布的NeuroD基因序列(GenBankNo．NM002500)，设计并合成4对miRNA的OligoDNA(分别简写为NeuroD．1、NeuroD．2、NeuroD．3、Neur0D-4)，退火形成双链DNA后，与载体pcDNA丌Ⅵ6．2．GW／EmGFP．miR连接，构建pcDNA。oM6．2．GW／EmGFP．miR-NeuroD表达载体，转化入感受态大肠杆菌DH5a；用Real．timePCR技术检测pcDNAⅢ6．2．GW／EmGFP．miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛

3、选出的干扰载体pcDNA刑6．2．GW／EmGFP．miR-NeuroDl与慢病毒载体pLenti6．3／V5．DEST经酶切后连接，构建慢病毒表达载体pLenti6．3．EGFP-NeuroDl．miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(packagingmix)共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定，利用绿色荧光蛋白作为报告基因，对病毒滴度和感染效率进行检测。3、使用重组慢病毒Lenti．EGFP-NeuroDl．miR及阴性病毒感染PANC-1细胞，使用倒置荧光显微镜观察荧光，确定慢病毒感染目的细胞的MO

4、I值；以GADPH为内参照，通过RT-PCR分析PANC．1细胞NeuroD基因mRNA表达水平的改变，确认干扰效果。采用CCK．8检测细胞的生长，流式细胞技术检测细胞的凋亡，Transwell检测迁移和侵袭等生物学行为的改变。裸鼠胰腺原位成瘤，观察稳定干扰NeuroD基因后，成瘤情况及侵袭能力的改变。结果：1、NeuroD、PCNA和p53蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为64．57％(导管腺癌为63．01％)、57．48％和59．06％，与非癌组织相比，差异有统计学意义(P<0．01)。NeuroD蛋白的表达与PCNA、p53蛋白的表达和胰腺癌肿瘤神经浸润之间有统计学相关

5、性(P<0．05)，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型及分化程度、瘤旁慢性胰腺炎、神经周围淋巴细胞套和淋巴结转移均等无统计学相关性。2、成功构建针对靶基因的4个干扰质粒，测序结果表明，4对pcDNATM6．2．GW／EmGFP．miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致，Real．timePCR检测显示以pcDNATM6．2．GW／EmGFP．miR-NeuroD．1的沉默效应最佳。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6．3．EGFP-NeuroDl．miR转染至293T细胞株，酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致，病毒滴度达1．18x108ifu／ml。3

6、、使用RNAi重组慢病毒稳定感染PANC．1细胞，NeuroD的mRNA表达水平明显下调。与对照组相比较，RNAi重组慢病毒抑制NeuroD表达后，PANC．1细胞的生长受到抑制，细胞凋亡比例无显著提高，迁移和侵袭的细胞数目减少。稳定干扰NeuroD基因后，PANC．1细胞的裸鼠胰腺原位成瘤明显小于对照组，侵袭能力减弱。结论；NelIroD蛋白在胰腺癌组织中呈高表达，可能参与了胰腺癌的发生和进展过程，并且与胰腺癌的增殖、p53信号通路和肿瘤神经浸润之间密切相关。成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体pLenti6．3．EGFP-NeuroDl．miR，

7、为进一步应用RNA干扰技术研究NeuroD基因的相关功能奠定了基础。通过RNAi重组慢病毒Lenti．EGFP-NeuroDl一miR转染PANC．1细胞，可以稳定、高效、特异性地抑制NeuroD的表达。沉默NewoD基因能显著抑制PANC．1细胞的体外和体内的增殖和侵袭能力。关键词：胰腺癌，神经源性分化蛋白，慢病毒，RNA干扰，增殖，侵袭-2-AbstractExpressionandFunctionalStudyofNeurogenicDifferentiationinPancreati