农杆菌介导获得的转基因棉花基因组中外源基因结构与整合方式

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1、山东师范大学硕士学位论文农杆菌介导获得的转基因棉花基因组中外源基因结构与整合方式姓名：马小波申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张军20070606独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得(注：如⋯一签名利、皮⋯刊衫手学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文

2、被查阅和借阅。本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名‘毛翻、；茜乙签字日期：2007年6月6日一茕2呼．山东师范大学硕士学位论文农杆菌介导获得的转基因棉花基因组中外源基因结构与整合方式中文摘要棉花是重要的经济作物，利用基因工程改良棉花品种、提高棉花的种植效益已经取得巨大成功。农杆菌介导的遗传转化方法是目前研究最多、应用最广的植物转基因方法，该方法因具有操作简便、转化效率高、较

3、少的插入拷贝数以及遗传稳定等优点，而被植物转基因工作者广泛推崇。现在已经建立了许多植物比较成熟的遗传转化体系，并且利用这些体系获得了商业化的玉米、大豆、棉花等转基因农作物。目前的研究已经明确证实，农杆菌能够将位于Ⅱ质粒上的两个25bps的正向重复的边界(左边界LeftBorder与右边界RightBorder)之间的一段DNA(转移DNA简称T．DNA)从质粒上切割下来并在质粒毒性区编码的各种毒性蛋白的作用之下穿过细菌和植物细胞进入到植物细胞核中，并在农杆菌编码的某些蛋白和植物细胞中的某些因子的共同作用之下整

4、合到植物的基因组中，但，T-DNA边界序列之外的载体序列偶尔也会整合到植物染色体上。T-DNA的整合无位点特异性，不需长片段的同源性，因此遵循“异常整合”的机制。虽然全球已经有大面积的转基因棉花在种植，但有关于棉花遗传转化中T-DNA结构以及整合机制的研究尚未见报道。越来越多的研究发现在许多的转基因植物中存在着相当比例的靠近左边界的载体骨架序列的整合，我们的研究利用双元载／gkpVZPlll构建的绿色荧光蛋白基因的简单质粒载体pPZP-GFP农杆菌介导转化陆地棉(GossypiumhirsutumL．)获得的

5、T0株系，发现存在相当数量的左边界以外的载体序列的整合和相当程度的串联重复的多拷贝的单位点整合以及一些重排或缺失的T-DNA结构单元。根据反向PeR．获得的T0代植株T-DNA整合位点的侧翼序列，设计了扩增棉花基因组中T-DNA插入位点的引物来扩增T-DNA插入前野生型陆地棉coke312序列，分析T-DNA的插入位点在T-DNA整合前后的序列变化。得到了八种T-DNA整合位点序列的变化。分析看出T-DNA的边界序列与插入位点存在着微同源性，存在比较普遍的插入位点序列的缺失，在左边界和基因组序列连接处存在着填

6、充DNA，它与紧邻左边界的载体骨架序列并没有同源性，可能来自植物的基因组序列，并且存在着正向和反向的重复甚至有回文结构。选择T0植株GFP47植株来研究哪NA插入位点的结构以及遗传稳定性，PCR山东师范大学硕士学位论文和Southern杂交分析证实其不仅整合了多个拷贝的正常的T-DNA，而且有紧邻T-DNA左边界的载体骨架序列的整合。对来源于GFP47的33个T1个体的PcR分析表明，Tl后代中可以分离出只有正常T-DNA整合的个体。对Tl群体中不同基因型个体的Southern杂交分析结果显示，该多拷贝整合的

7、To转化体至少在棉花基因组中有四个插入位点且位于不同的染色体上，不同的Southern带型暗示不同插入位点的T-DNA结构和排布有很大的不同。至少有一个位点整合了只包括目的基因和选择标记基因在内的正常T-DNA结构。关键词：棉花、农杆菌、转基因、多位点整合、T-DNA载体骨架、Southern杂交、PCR、反向PCR、序列分析分类号：Q782山东师范大学硕士学位论文TransgeneStructureandIntegrationPatterninGenomeofTransgenicCotton(Gossypl

8、umhisutumL．)viaAgrobacterium-mediatedTransformationAbstractCotton(Gossypiumspp．)istheworld’Sleadingfibercropsandthus缸importantcashcropforitsnaturalfiber．AmongthefourcultivatedGossypiumspeciesintheworld