体外长期扩增对脐带间质干细胞生物学特性的影响及建立h2o2诱导的早衰细胞模型

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1、分类号墅2窆：至UDC612密级公珏编号102—99—S1114—02—8汪蒜大擎硕士学位论文体外长期扩增对脐带间质干细胞生物学特性的影晌及建立H202诱导的早衰细胞模型EFFECTSOFLONG．TEItMVITROEXPANSIONONTHEBIOLOGYCHARACTERISTICSOFHUMANUMBILICALCORDSTEMCELLSANDESTABLISHAH202一INDUCEDPREMATURECELLMODEL作者姓名：孙敏指导教师：孙晓春副教授小组成员：胡嘉波教授谷俊侠副教授申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学’论文提交同期：2014年4月

2、论文答辩同期：2014年6月7R学位授予单位：江苏大学答辩委员会主席：朱伟评阅人：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：疑彤．日期：力l够年6月lI．H学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅

3、和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密函。学位论文作者签名：舢鲰指导教师签名：力J牛年6月f1日沙J斗年占月ff日江苏大学硕士学位论文摘要目的：在体外扩增培养的过程中，探讨不同传代次数的人脐带间质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC．MSCs)生物学特征的改变及建立过氧化氢(H202)诱导的人脐带间质干细胞早衰模型，进而探索氧化应激与脐带问质干细胞衰老的可能

4、关联，从而为临床选用优质干细胞治疗提供相应参考依据。方法：(1)分离培养hUC．MSCs，采用组织块贴壁法。借助于形态特征、表面抗原标记等对其进行生物学特性鉴定。(2)原代培养细胞作为PO代hUC．MSCs，分别选取第4代(P4)，第11代(P11)，第17代(P17)分别代表年轻组，中年组及老年组。比较脐带间质干细胞在体外传代扩增的过程中，这三个阶段干细胞生物学性状上的差异。扫描电镜观察细胞膜表面超微结构及免疫荧光法检测细胞核染色质变化；MTT方法用于检测细胞增殖活力；采用衰老相关13．半乳糖苷酶染色(SA．13．gal)，检测不同代数hUC．MSCs衰老的变化

5、：茜素红染色检测不同代数hUC—MSCs成骨分化，油红0细胞化学染色检测其成脂分化能力：流式细胞仪分析检测细胞周期及检测细胞PqROS表达量水平；免疫荧光法验证ROS在细胞内的定位：通过收集条件培养基，我们采用transwell迁移实验检测不同代数细胞分泌细胞因子的差异，从而间接反映不同传代能力hUC．MSCs分泌细胞因子的差异。RT．PCR技术检测衰老基因p"，p21及氧化还原因子APEl／Ref-J表达情况。(3)为探讨衰老与氧化应激的关系，我们选用不同浓度的氧化3眷lJH202处理年轻组P4代hUC．MSCs，检测B．半乳糖苷酶活性，细胞周期及相应基因p53

6、，p21／Xf“IPEl／Ref-J情况。(4)采用GraphPadPrism5．0软件进行数据统计分析，当p

7、细胞伪足增多，增多的伪足数目不一。此种变化在P17代表现尤其明显。DAPI染核显示，在年轻组细胞核中DNA呈均一分布，而老年组细胞核则呈现十分明显的DNA点块状聚集，即衰老相关异染色质聚集(senescence—associatedheterochromaticfoci，SAHF)。中年组细胞核DNA染色质相对均一，虽未达到点状聚集状态，但有丌始聚集趋向，可能处在一种过渡衰老状态。衰老相关B．半乳糖菅酶(SA．13．gal)染色显示，年轻组，中年组，老年组阳性率分别为：体外长期扩增对脐带间质干细胞生物学特性的影响及建立H202诱导的早衰细胞模型1．15％，35．3

8、％，65．