高糖环境对角膜上皮修复和角膜缘干细胞活性影响的实验研究

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1、青岛大学硕士学位论文高糖环境对角膜上皮修复和角膜缘干细胞活性影响的实验研究姓名：张梅爱申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：史伟云20120602目的摘要利用角膜缘干细胞体外模型和Ins2Akita糖尿病小鼠模型，研究高糖环境对角膜缘上皮干细胞活性以及角膜上皮修复的影响。1．采用小鼠角膜缘上皮干／祖细胞系(TKE2)作为体外细胞模型，在培养基中添加终浓度为30mM的葡萄糖进行处理，模拟糖尿病角膜病变的高糖微环境，通过相差显微镜观察、MTT、干细胞克隆形成、AnnexinV．PI和8-OHdG(DNA单链断裂标记)免疫染色等实验，观察

2、高糖环境对角膜上皮干细胞形态变化、克隆形成能力、细胞增殖、凋亡、DNA稳定性等方面的影响。2．选择同龄成年雄性C57BL／6小鼠(正常对照组)和Ins2Akita小鼠(糖尿病组)各10只，比较2组小鼠在体重、血糖水平的差异；刮除小鼠角膜中央2mm的上皮，观察并比较角膜上皮在损伤后Oh、24h、48h、64h、76h、88h、100h、136、172h的修复情况，并通过透射电镜、HE．．染色、TUNEL(凋亡)标记染色、8-OHdG对角膜上皮的形态改变、细胞凋亡及DNA稳定性进行检测分析。结果1．体外细胞模型的结果显示，高糖处理后的TK

3、E2细胞呈长梭形，随着高糖处理时间的延长，细胞状态变差；高糖组干细胞克隆直径较小，克隆形成率明显降低(正常组为28．3334-5．508，高糖处理3代TKE2克隆形成率为6．333+1．155)，比较有统计学意义(P<0．05)；MTT检测发现，正常组和高糖处理1代细胞间增殖能力有差异(P72h=0．013)，高糖处理3代后差异更为明显(P72h=0．000)；细胞凋亡检测示正常组早期凋亡细胞比例为8．02_a：3．14，高糖组早期凋亡细胞比例为33．134-2．63，差异有统计学意义(P

4、G阳性染色较正常细胞明显增强。2．Ins2Akita糖尿病小鼠在8周的检测周期内，其体重增加与正常小鼠相比明显减少，血糖维持在相对稳定的高水平；糖尿病组小鼠的角膜上皮愈合时间为刮除后172h，愈合速度较正常对照组(48h)明显延迟，并且在88h出现缺损面积的扩大；电镜观察显示，糖尿病小鼠角膜上皮细胞表面微绒毛和微皱褶明显减少，角膜基底层上皮细胞排列尚规则，但细胞体积增大，基底细胞空泡化明显，细胞间桥粒连接较少，角膜上皮与基底膜间的半桥粒明显减少；HE．．染色示糖尿＼＼删必病小鼠角膜上皮细胞表面不平整，形态不规则，细胞间连接疏松，细胞层

5、数减少，分界不清，角膜上皮层基底细胞空泡形成，基质层明显水肿；TUNEL结果示角膜上皮基底层细胞TUNEL标记染色较正常组明显增多；8-OHdG的染色结果示角膜上皮基底层细胞8-OHdG标记染色阳性细胞较正常对照组明显增多。结论1．体外高糖处理条件下，角膜上皮干细胞的形态发生改变，角膜上皮干细胞的克隆形成能力和增殖明显受到抑制；早期凋亡细胞明显增多；基因组稳定性下降。2．Ins2Akita糖尿病小鼠角膜上皮修复速度明显减慢，并出现反复剥脱现象；角膜基底层的上皮细胞形态变化明显、角膜上皮基底层细胞的凋亡增加及其DNA稳定性下降。关键词：

6、Ins2Akita糖尿病小鼠；角膜上皮干细胞；高糖；活性PurposeAbstractToanalysistheeffectofhi曲glucoseontheactivityofcorneallimbalstemcellsandcornealepitheliumusingcultivatedcomeallimbalstemcellsandthemodelofTypeIdiabetesmellitus(Dr0ofIns2Akita．Methods1．Usingmousecornealepitheliumstem／progenitorce

7、lllinesasvitromodel，addingfinal30Mmolglucoseinthemediumtosimulatehi．曲glucosemicroenvironmentofdiabetickeratopathy．Byphasecontrastmicroscopy,MTT,stemcellcloneformation,AnnexinV-PIandimmunostainingexperimentsof8-OHdG(DNAsingle-strandbreaks)，andobservingtheeffectofhighgluc

8、oseonthemorphology,colonyformingability,cellproliferation,cellapoptosis，thestabilityofDNAofcomealepithelium．2．