沉默信号调控因子1蛋白促进高糖环境下角膜上皮细胞损伤修复的实验研究

《沉默信号调控因子1蛋白促进高糖环境下角膜上皮细胞损伤修复的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要第一部分沉默信号调控因子1(Sirtl)在I型糖尿病模型小鼠角膜和三叉神经节中的表达目的：探讨沉默信号调控因子(Sirtl)在1型糖尿病模型C57BL／6．／n∥触+／J小鼠的角膜和三叉神经节中的表达，为明确Sirtl与糖尿病性角膜病变的关系奠定基础。方法：取雄性C57BL／6．1nsZkita+／J小鼠与同窝出生的野生型雄性C57BL／6．Ins2“+小鼠各8只，分别作为l型糖尿病模型组和正常对照组。分别于24周龄、28周龄、32周龄、36周龄、40周龄、44周龄、48周龄测量两组小鼠的体重、血糖、泪液分泌情况，同时行虎红染色观察泪膜及上皮情况

2、；于48周龄时颈椎脱臼法处死，取小鼠的三叉神经节和角膜组织。采用苏木素一伊红染色显示两组小鼠的角膜和三叉神经节的组织病理学变化：行免疫组织化学法检测角膜和三叉神经节中Sirtl蛋白的表达和定位：行荧光定量PCR法检测SirtlmRNA在角膜和三叉神经节中的表达；行Westernblot检测两组小鼠角膜和三叉神经节中Sirtl蛋白的相对表达量，并进行统计学分析。结果：与C57BL／6．／ns2坍野生型小鼠相比，C57BL／6．如∥胁+／J小鼠的体重明显较轻(f=22．784，P=-0．000)，泪液分泌减少(t=10．693，P=-0．000)，虎红染

3、色着色明显。C57BL／6．砌∥触时／J小鼠的三叉神经节细胞大小不均匀，排列较疏松，神经纤维排列较散乱，角膜上皮变薄、细胞层数减少；而C57BL／6．砌妇“+野生型小鼠的神经节细胞大小、形态较为均一，排列紧密、整齐，神经纤维排列较整齐。荧光定量PCR显示，SirtlmRNA在C57BL／6．扬∥触+／J小鼠角膜的表达强度显著低于野生型C57BL／6．1ns2“+小鼠(0．53+0．08vs．0．97+0．12)，差异有统计学意义(f=5．863，P=-0．003)：在C57BL／6．Insr砌+／J小鼠三叉神经节的表达灰度为2．43士0．19，低于野

4、生型C57BL／6．砌妇“+小鼠(2．50-2：0．23)，但差异无统计学意义(t=0．582，P=-0．611)。Westernblot显示，C57BL／6-Ins2A胁口+／J小鼠角膜中Sirtl蛋白的表达明显低于野生型C57BL／6．Ins2“+小鼠(0．778士0．017vs．1．306士0．014)，差异有统计学意义(t=33．141，P=-0．001)；但Sirtl蛋白在两组小鼠的三叉神经节中的表达差异无统计学意义(1．100士0．016VS．1．108士0．018，t=O．431，P=O．708)。结论：Sirtl在48周龄1型糖尿病C

5、57BL／6．砌s夕崩甜／J小鼠的角膜中的表达I黜黜降低，提示Sirtl有可能参与糖尿病性角膜病变。第二部分过量表达Sirtl蛋白对高糖环境下角膜上皮损伤修复的影响目的：研究Sirtl对高糖环境下角膜上皮损伤修复的影响及其作用机制。方法：取雄性C57BL／6．扬∥砌+／J小鼠20只与同窝出生的野生型雄性C57BL／6．Ins2坍野生型小鼠5只分成五组：C57BL／6．Ins2州+野生型小鼠角膜损伤不处理组、C57BL／6．Ins24触+／J小鼠角膜损伤不处理组、C57BL／6．Ins2彳胁+／J小鼠角膜损伤结膜下注射生理盐水组(10uL)、C57BL

6、／6．砌s夕触+／J小鼠角膜损伤结膜下注射Ad．GFP组(10uL滴度为1011的重组GFP腺病毒)和C57BL／6．In．∥砌+／J小鼠角膜损伤结膜下注射Ad．Sirtl组(10uL滴度为1011的重组Sirtl腺病毒)。角膜上皮刮除后，立即结膜下注射相应物质。损伤48h后，通过Westernblot分别比较前两组之问、后四组之问小鼠角膜组织中乙酰化p53、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3蛋白)、胰岛素样生长因子1受体(IGF．1R)、乙酰化的蛋A激酶B(p-AKT)等蛋A的表达量，进而显示过量表达Sirtl对C57BL／6．砌s少砌+／J

7、小鼠角膜组织中p53、IGFBP3／IGF．1／AKT的表达的影响。通过荧光素钠染色并分别于伤后0h、24h、48h裂隙等下观察并照相显示过量表达Sirtl对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响。结果：糖尿病小鼠角膜上皮刮除后，荧光素钠染色结果表明结膜下注射重组SIRTl腺病毒的糖尿病小鼠48小时后角膜上皮损伤愈合的面积显著低于未进行SIRTl腺病毒注射组，说明过量表达Sirtl后促进了糖尿病小鼠角膜的损伤修复。与野生型小鼠相比，糖尿病小鼠的角膜组织中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表达明显上调，而Sirtl、IGF．1R、p-AKT显著下调。结膜下注射重

8、组SIRTl腺病毒的C57BL／6．砌s少讹+／J小鼠的角膜组织中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表达较未注射