三种血小板生成关键因子共转染人骨髓基质细胞的实验研究

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1、第三军医大学硕士学位论文三种血小板生成关键因子共转染人骨髓基质细胞的实验研究姓名：林放申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：赵树铭201205第三军医大学硕士学位论文三种血小板生成关键因子共转染人骨髓基质细胞的实验研究摘要目的：通过构建TPO—pECFP—N1、IL一6一pcDNA3．1(+)、IL．11一pcDNA3．1(一)--个真核表达载体，并用脂质体转染法共转染人骨髓基质细胞，观察三个真核表达载体在人骨髓基质细胞中的表达情况。方法：1、分别对TPO、IL一6、IL．11三个基因片段克隆，再用PCR

2、技术将克隆出来的TPO、IL一6、IL一11基因片段和pEGFP—N1、pcDNA3．1(+)、pcDNA3．1(一)这三个质粒分别连接，构建成TPO—pEGFP—N1、IL一6一pcDNA3．1(+)、IL一11一pcDNA3．1(一)三个真核表达载体，并进行酶切鉴定及测序分析。2、用贴壁筛选法对人骨髓基质细胞进行分离，选用分裂能力强的第三代细胞做为转基因的靶细胞，用脂质体转染法将TPO—pEGFP—N1、IL一6一pcDNA3．1(+)、IL一11-pcDNA3．1(一)三个真核表达载体共转染人骨髓基质细胞，并

3、采用细胞免疫组化及Westernblot法等方法检测多基因转染人骨髓基质细胞后在mRNA和蛋白水平的表达。结果：1、酶切及测序结果证实，本实验成功构建TPO—pEGFP—N1、IL一6一pcDNA3．1(+)、IL一11-pcDNA3．1(一)三个真核表达载体。2、人骨髓基质细胞的体外培养形态呈异质性，原代细胞呈集落生长，传代后则均匀生长。3、TPO—pEGFP—N1、IL一6一pcDNA3．1(+)、IL一11一pcDNA3．1(一)三个真核表达载体转染人骨髓基质细胞后，荧光显微镜下可观察到TPO—pEGFP—N

4、1的表达，25％细胞发出绿色荧光；免疫细胞化学染色检测出IL一6及几．11在细胞内表达；经Westernblot检测：TPO蛋白表达(TPO／GAPDHIOD比值)在正常对照组为(O．17±o．01)，空载体转染组为(0．18_+0．01)，多基因转染组为(O．62_+0．01)；IL一6蛋白表达(IL一6／GAPDHIOD比值)5第三军医大学硕士学位论文在正常对照组为(0．14_+0．01)，空载体转染组为(O．18_+0．04)，多基因转染组为(O。34_+0．06)；Ⅲ一1l蛋白表达(几一11／GAPDHIO

5、D比值)在正常对照组为的(0，8+0．23)，空载体转染组为(0．19_-+-0．14)，多基因转染组为(1。62_-+-0．23)。多基因转染组细胞的蛋白水平明显高于对照组(P均

6、。关键词：TPO；IL一6；IL．11；骨髓基质细胞；共转染6AnexperimentalstudyontheCO．transfectionofhumanmarrowstromalcellswiththreemainhematopoieticgrowthfactorsObjective：AbstractToconstructthreeeukaryoticexpressionvectorsTPO—pEGFP—N1，IL·6一pcDNA3．1(+)andIL一11’pcDNA3．1(一)，CO—transfectint

7、ohumanmarrowstromalcellsbyliposometransfection，andthenobservetheexpressionofthethreeeukaryoticexpressionvectorsinhumanmarrowstromalcells．Methods：1．ThreegenefragmentsofIPO，IL一6andIL一11wereclonedrespectively．ThenthecopiesofIPO，IL-6andIL一11genewasligatedtoplasmid

8、pEGFP—N1，pcDNA3．1(+)andpcDNA3．1(一)respectivelybyPCRamplification，toformeukaryoticexpressionvectorsTPO—pEGFP—N1，IL一6一pcDNA3．1(+)andIL一11一pcDNA3．1(一)．Byrestrictionmappingandsequencea