hre调控vegf表达转染nscs的实验研究

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1、中图分类号』丝UDC610硕士学位论文学校代码密级HRE调控VEGF表达转染NSCs的实验研究ExperimentstudyofHREregulating10533VEGF-expressiontransfectedneuralstemceUs作者姓名：谭丹凤学科专业：临床医学研究方向：儿科学学院(系、所)：湘雅医院指导教师：郑湘榕副教授论文答辩日期塑!!!墨坠答辩委员会主席塑聋』中南大学二O一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含

2、为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：鲨!i年上月4日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：虹导师签名社日期：丝生年』月孕日硕士学位论文中文摘要HRE调控VEGF表达转染NSC

3、s的实验研究摘要目的：获得表达血管内皮生长因子(vascularendotllelial铲owtllfactor，VEG．F)的基因工程神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)，研究缺氧反应元件(hypoxia．r印onsiveelement，Ⅻ礓)在缺氧条件下是否能提高Ⅵ三GF基因的表达，以期为缺氧缺血性脑损伤寻求一种安全、高效的基因治疗方法。方法：分离胎龄14天的SD大鼠胚胎前脑皮质，采用无血清培养的方法获得细胞克隆，应用间接免疫荧光法鉴定NSCs和分化的神经细胞。构建携带VEGFl65基因的两种重组慢病毒载体pGC．FU-Ⅵ三GFl65，及9Ⅷ迮-pGC．FU．ⅦGF

4、l65，将两者分别转染NSCs细胞，转染后的NSCs分为7组：A组为转染pGC．FU．VEGFl65重组慢病毒后于常氧条件下培养的神经干细胞、B1组为转染9Ⅷ迎．pGC．FU．Ⅵ三GFl65重组慢病毒后于常氧条件下培养的神经干细胞，B2组为转染9Ⅷ也-pGC．FU．ⅦGFl65重组慢病毒后于缺氧条件下培养6h的神经干细胞，B3组为转染9Ⅷ也．pGC．FU-VEGFl65重组慢病毒后于缺氧条件下培养12h的神经干细胞，B4组为转染9Ⅷ也．pGC．FU．Ⅵ三G．F165重组慢病毒后于缺氧条件下培养24h的神经干细胞，C组为转染空载体慢病毒于常氧条件下培养的神经干细胞，D组为未转染慢病毒于常氧

5、条件下培养的神经干细胞作为的空白对本课题受编号：81070523的国家自然科学基金课题资助。硕士学位论文中文摘要照组，(常氧条件为95％02+5％C02；缺氧条件为2％02+98％N2)；荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率，采用RT-PCR法检测转基因NSCs的ⅦG．F基因表达水平，W

6、estem．blot及Elisa检测转染后细胞分泌型血管内皮生长蛋白的表达水平，MTT法检测转染后NSCs的增殖活性。结果：①离体培养的胎鼠神经干细胞呈Nestin阳性；②经测序两组目的基因与GenBb址中序列完全一致，成功构建}Ⅱ也-pGC-FU-Ⅵ三GrF165重组慢病毒、pGC．FU—VE(m165

7、慢病毒载体；③将慢病毒转染至神经干细胞分组后在荧光显微镜下观察可见A组、B2组、B3组、B4组、C组基因工程神经干细胞发出绿色荧光，B1组、D组未见绿色荧光；经流式细胞仪检测A组细胞转染率50％左右，B2组、B3组、B4组、C组细胞转染率为80％左右，B1组、D组细胞转染率为O．49％左右；④RT-PCR检测C组、D组、B1组细胞无明显ⅦGFmRNA表达，B2组、B3组、B4组、A组细胞均表达VEGFmRNA，B2组、B3组、B4组细胞ⅦGFmRNA表达量显著高于A组∽0．05)，且B组内细胞随着缺氧时间延长ⅦGFmRNA表达量增高衅O．05)；⑤W．estem-blot检测C组、D组、

8、B1组无明显Ⅵ三GF蛋白表达，B2组、B3组、B4组、A组细胞均表达VEGF蛋白，B2组、B3组、B4组细胞ⅦGF蛋白表达量高于A组(尸