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《可调控重组腺相关病毒对mcf7细胞基因转染效率及表达的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究作者:王燕燕,宋兴福,崔向军,黄骥【摘要】目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)体外诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶9(cystEinecontainingaspartate9,caspase9)和caspase3活性的影响。方法Art处理A549细胞,流式细胞计数(Floetry,FCM)检测细胞周期和细胞凋亡,比色法检测caspase9活性,g/LArt作用24h,出现S期细胞减少(P<0.01),G2/M期细胞数目增多(P<0.01),细胞凋
2、亡率增加(P<0.0)。不同浓度(10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L)的Art作用A549细胞24h,caspase9活性呈浓度依赖性增加,分别为对照组的9.87倍、23.33倍(P<0.01)、38.47倍(P<0.01)和60.47倍(P<0.01)。ethodsA549cellsetry.Activationofcaspase9etricassay.Changeofcaspase3ent,markedcellaccumulationinG2/Mphaseg/LArtexposurefor24h.
3、Inaddition,thepercentageofapoptosisincreased,from(3.5±0.7)%incontrolculturestoapproximately(19.4±1.5)%after100mg/LArttreatedfor24h.caspase9colorimetricassayshoent,caspase9activityincreasedinadosedependentmanner.AfterA549cellstreatedg/LArtfor6h,12hand24h,theactivityofcaspase3
4、increasededium1640)和胰蛋白酶,Gibco公司;胎牛血清(Fetalcalfserum,FCS),杭州四季青公司;碘化丙啶(PI),Sigma公司;caspase9colorimetricassaykit,Calbiochem公司;ECLkit,KirkegaardPerryLaboratories公司;兔多克隆抗caspase3抗体(H277,sc7148,可识别caspase3酶原和p11、p17、p20caspase3)和βactin(C2,sc8432)均为SantaCruz产品;丙烯酰胺、N,N甲叉丙烯酰胺
5、、SDS、Triscl、牛血清白蛋白(BSA)、硝酸纤维素膜(NC膜)、考马斯亮兰R250、过硫酸胺(AP)均为Amersco产品。酶标仪(GENiosVA200),奥地利TECAN公司;流式细胞仪(EPICSALTRAII),美国Beckman公司;凝胶成像系统(BioID),法国VL公司。 1.2细胞培养人肺腺癌细胞株A549,购自武汉大学中国典藏物保存中心,接种于含10%FCS的RPMI1640培养液中,置37℃、5%CO2孵箱中常规培养,每2~3d传代1次。 1.3流式细胞计数(Floetry,FCM)检测细胞周期和凋亡100mg/L
6、Art处理细胞,24h后收集细胞,用冷PBS(0.01MpH7.4)漂洗,滴加80%乙醇-20℃固定过夜。RNA酶(1mg/ml)37℃孵育30min,冰上2min,PI综合染液(含100mg/LPI、0.1%TritonX100)暗处孵育30min。上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。细胞周期统计及凋亡分析采用数据获取软件CELLQuest及DNA分析软件ModFitLT。 1.4检测caspase9活性A549细胞分别暴露于不同浓度(10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L)的Art,24h后采用比色法检测细胞浆中caspase
7、9活性。检测方法参照caspase9colorimetricassaykit说明书,简述如下:先采用终浓度分别为0、50、100、200和400mg/L标准物的吸光度绘制标准曲线。收集5×106细胞,加入50μl预冷的细胞裂解液,冰上孵育10min,4℃、10000×g离心1min,收集上清液为细胞抽提物,计算蛋白浓度。96孔板中加入用缓冲液稀释的蛋白样本50μl、2×反应缓冲液(含10mMDTT)50μl、4mMLEHDpNA底物5μl,37℃孵育1h,酶标仪上读取405nm波长处的吸光度值(A值),caspase9活性单位(U)=(各组A值
8、-凋零组A值)/标准曲线斜率,每组重复4孔。 1.5期阻滞和细胞凋亡。 表1100mg/L