可调控重组腺相关病毒对mcf7细胞基因转染效率及表达的研究

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1、可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究作者：王燕燕，宋兴福，崔向军，黄骥【摘要】目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)体外诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶9(cystEinecontainingaspartate9,caspase9)和caspase3活性的影响。方法Art处理A549细胞，流式细胞计数(Floetry,FCM)检测细胞周期和细胞凋亡，比色法检测caspase9活性，g/LArt作用24h，出现S期细胞减少(P<0.01)，G2/M期细胞数目增多(P<0.01)，细胞凋

2、亡率增加(P<0.0)。不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art作用A549细胞24h，caspase9活性呈浓度依赖性增加，分别为对照组的9.87倍、23.33倍（P<0.01）、38.47倍（P<0.01）和60.47倍（P<0.01）。ethodsA549cellsetry.Activationofcaspase9etricassay.Changeofcaspase3ent,markedcellaccumulationinG2/Mphaseg/LArtexposurefor24h.

3、Inaddition,thepercentageofapoptosisincreased,from(3.5±0.7)%incontrolculturestoapproximately（19.4±1.5）%after100mg/LArttreatedfor24h.caspase9colorimetricassayshoent,caspase9activityincreasedinadosedependentmanner.AfterA549cellstreatedg/LArtfor6h,12hand24h,theactivityofcaspase3

4、increasededium1640）和胰蛋白酶，Gibco公司；胎牛血清（Fetalcalfserum,FCS），杭州四季青公司；碘化丙啶（PI）,Sigma公司；caspase9colorimetricassaykit，Calbiochem公司；ECLkit，KirkegaardPerryLaboratories公司；兔多克隆抗caspase3抗体（H277,sc7148,可识别caspase3酶原和p11、p17、p20caspase3）和βactin(C2,sc8432)均为SantaCruz产品；丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺

5、、SDS、Triscl、牛血清白蛋白（BSA）、硝酸纤维素膜（NC膜）、考马斯亮兰R250、过硫酸胺（AP）均为Amersco产品。酶标仪(GENiosVA200)，奥地利TECAN公司；流式细胞仪（EPICSALTRAII），美国Beckman公司；凝胶成像系统(BioID)，法国VL公司。　　1.2细胞培养人肺腺癌细胞株A549,购自武汉大学中国典藏物保存中心，接种于含10%FCS的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2孵箱中常规培养，每2～3d传代1次。　　1.3流式细胞计数（Floetry,FCM）检测细胞周期和凋亡100mg/L

6、Art处理细胞，24h后收集细胞，用冷PBS（0.01MpH7.4）漂洗，滴加80%乙醇-20℃固定过夜。RNA酶(1mg/ml)37℃孵育30min，冰上2min，PI综合染液（含100mg/LPI、0.1%TritonX100）暗处孵育30min。上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。细胞周期统计及凋亡分析采用数据获取软件CELLQuest及DNA分析软件ModFitLT。　　1.4检测caspase9活性A549细胞分别暴露于不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art，24h后采用比色法检测细胞浆中caspase

7、9活性。检测方法参照caspase9colorimetricassaykit说明书，简述如下：先采用终浓度分别为0、50、100、200和400mg/L标准物的吸光度绘制标准曲线。收集5×106细胞，加入50μl预冷的细胞裂解液，冰上孵育10min，4℃、10000×g离心1min，收集上清液为细胞抽提物，计算蛋白浓度。96孔板中加入用缓冲液稀释的蛋白样本50μl、2×反应缓冲液（含10mMDTT）50μl、4mMLEHDpNA底物5μl，37℃孵育1h，酶标仪上读取405nm波长处的吸光度值（A值），caspase9活性单位(U)=(各组A值

8、-凋零组A值)/标准曲线斜率，每组重复4孔。　　1.5期阻滞和细胞凋亡。　　表1100mg/L