鼻咽癌发生相关下调基因筛选及annexin a6基因在鼻咽癌中的表达研究

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1、万方数据中图分类号UDCR446．1610硕士学位论文学校代码密级10533鼻咽癌发生相关下调基因筛选及A肌exinA6基因在鼻咽癌中的表达研究ScreeningofdownregulatedgenesrelatedtotheoccurrenceofnasopharyngealcarcinomaandtheexpressionofAnnexinA6innasopharyngealcarcinoma作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：朱乐攀临床医学临床检验诊断学湘雅医院易斌教授论文答辩日期21兰兰!塑答辩委员会主席中南大学二。一四年

2、五月学位论文原创性声明恻渊掣燃万方数据本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：日期：尘丝年三月望日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交

3、学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：辑导师签日期：旦坚年三月翌日日期：童监年上月望日

4、-一＼＼＼万方数据本课题受以下基金资助[1]国家自然科学基金“采用定量蛋白质组学技术筛选与鼻咽癌发生和转移相关的甲基化基因”(81071796)[2]国家自然科学基金“采用定量蛋白质组学技术筛选与鼻咽癌化疗耐药相关的甲基化基因”(81172098)万方数据硕士学位论文中文摘要鼻咽癌发生相关下调基因筛

5、选及AnnexinA6基因在鼻咽癌中的表达研究摘要目的：首先以永生化的鼻咽上皮细胞株(NP69)和鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)细胞株(6．10B、5-8F)为研究模型，从蛋白表达谱入手，采用定量蛋白质组学技术筛选NPC中发生相关下调基因。而后从发生相关下调基因中选取AnnexinA6(ANXA6)为研究对象，检测ANXA6基因在5．8F、6．10B和NP69细胞株中的甲基化情况，初步阐明ANXA6在NPC中表达下调的部分机制以及在NPC中的作用。方法：培养永生化的鼻咽上皮细胞NP69和NPC细胞6．10B、5．8F

6、，分别抽提蛋白质，测量蛋白浓度，采用同位素标记相对和绝对定量(Isobarictagsforrelativeandabsolutequantification，iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(2DLC．MS／MS)的方法分离鉴定三株细胞的差异表达蛋白，实验重复两次。通过ProteinPiloffM4．2软件进行Swissprot蛋白数据库搜索及鉴定，从中筛选出6．10B和5．8F两株NPC细胞相对NP69表达都下调的差异蛋白，并进行生物信息学分析。进一步挑选ANXA6基因采用qRT-PCR(QuantitativeReversetranscri

7、ptasePolymerasechainreaction)检测5—8F、6．10B和NP69中mRNA的表达水平；采用蛋白印迹法(WestemBlotting)验证ANXA6蛋白在5．8F、6．10B和NP69三株细胞中的表达水平；采用免疫组织化学检测ANXA6蛋白在NPC组织和鼻咽上皮组织中的表达情况，万方数据硕士学位论文中文摘要同时统计分析NPC中ANXA6蛋白表达水平与临床病理特征的关系；采用亚硫酸氢盐测序法检测ANXA6基因在5．8F、6．10B和NP69细胞株中的甲基化情况。应用SPSSl7．0统计软件进行数据分析。结果：根据筛选条件，筛选

8、出两株NPC细胞相对NP69低表达的差异蛋白98个，经生物信息学分析发现，这些蛋白通过多种信号通路在鼻咽癌发生过程中发挥作用。挑选ANXA6进一步研究，qPCR和Westernblotting结果显示mRNA和蛋白表达情况与iTRAQ的结果一致：NP69表达高于6．10B，6．10B表达高于5．8F，两两比较有统计学意义；免疫组织化学检测发现ANXA6在NPC组织中表达低于鼻咽上皮组织(氏O．001)，且ANXA6蛋白表达水平与NPC的淋巴结和远处转移、临床分期密切相关；亚硫酸氢盐修饰后基因测序发现NP69细胞ANXA6基因无甲基化，而6．10B和5

9、．8F存在不同程度的甲基化，其甲基化百分比分别为25．6％、17．9％，NP69与6．10B和5．8F比较差