放射线诱导自杀基因在鼻咽癌的靶向表达研究

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1、放射线诱导自杀基因在鼻咽癌的靶向表达研究中文摘要目的：通过克隆人Egr-1启动子，构建由Egr-1启动子调控，含Egr一卜cD基因的莺组真核表达载体pcDNA3．1(+)Egr一1-cD并转染鼻咽癌细胞系(CNE)，达到放射线诱导cW5一Fc自杀基因系统在鼻咽癌细胞中靶向表达，观察基因表达与放射的剂量效应关系，建立肿瘤基因——放射治疗系统，通过放射线和基因的双重作用杀伤肿瘤，提高放射增敏比，降低放疗剂量，减少正常组织损伤。方法t根据Genbank数据库提供的人Egr—l启动予基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从人肝组织DNA中

2、扩增出Egr—l基因片断，与pcDNA3．1(+)一cD定向连接，构建受控于Egr一1启动子的peDNA3．1(+)一cD真核表达载体pcDNA3．1(+)Egr一1一CD，用限制性内切酶，PCR扩增和DNA测序的方法鉴定真核表达载体pcDNA3．1(+)Egr一卜cD构建成功，并利用脂质体转染的方法转染人鼻咽癌细胞株，经G418筛选后获得表达阳性细胞克隆，RT—PCR分析鉴定转染成功。用不同剂量的x线照射表达阳性的鼻咽癌细胞，观察基因表达与放射的剂量效应关系，进一步体外分组观察不同的放射线诱导CD／5一Fc自杀基因系统对鼻咽癌细胞的杀伤效应，

3、MTT方法检测细胞存活比率，通过绘制不同组鼻咽癌细胞存活曲线，观察放射增敏作用。结果：成功克隆了人Egr～l启动子，构建了真核表达载体pcDNA3．1(+)Egr一1弋D。经过限制性内切酶，PCR和DNA测序证实了其正确性，CD基因转染CNE细胞后，经G418筛选后获得阳性克隆株Egr—l_cD—cNE，经RT-PCR分析CD基因已转入CNE细胞并开始转录。电离辐射可诱导增强自杀基因阳性细胞株中cD基因的表达，电离辐射与前药5一Fc的联合应用大大增强了对自杀基因阳性CNE细胞的杀伤作用，其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独照射。结论：真核表

4、达载体pcDNA3．1(+)Egr一1一CD构建及转染CNE细胞成功，建立了基因表达与放射的剂量效应关系，放射线诱导Egr-1_cD／5-Fc体系的放射增敏比明显提高，为我们下一步将放射敏感性CD基因表达载体直接注入瘤体，进行体内研究奠定了实验基础。关键词Eg卜l启动子CD自杀基因辐射诱导鼻咽癌细胞株StudyonthetargetedexpressionofsuicidegeneinducedbyradiationinnasopharyngealcarcinomacellABSTRACTobjective：TOclonethepromoter

5、ofEgr-IgeneofhumanandconstructrecombinanteukaryoticexpressionplasmidpcDNA3．1(+)Egr-I-CD，trans—fectingintohumannasopharyngealcarcinomacelllinebyLipofectamineTM，inductthetargetedexpressionofCD／5一FcSuicidegenesysteminpositiveclonenasopharyngealcarcinomacelllinebyionizingradiati

6、on，observetherelationbetweenionizingradiationdoseeffectandgeneexpression．EstablishtulTlOrgene-mdiotherapysystem．Thetumorcellswillbekilledsimultaneouslybygeneandirradiation，lowertheradiationdoseanddecreasethedamageofnormaltissue．Methods：DesignapairofprimerstoclonehumanEgr-1pr

7、omoterbasinghumanEgr-IgenesequenceinGenbank．UsingPCR,enzymerestriction，ligationandothermoleculartechnologytoconstructpcDNA3．1(+)Egr-1一CDrecombinantexpressionplasmid,andtransfectingintohumannasopharyngealcarcinomacelllinebyLipofectamineTMandwereculturedinG418medium．itwasprove

8、dthatthetransfectingWassuccessfulbyRT-PCR．observetherelationbetweenionizing