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1、鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究论文李晓霞，李瑞平，杜紫明，曾木圣，邵建永【摘要】【目的】应用miRNAs芯片筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，并寻找差异表达miRNAs调控的靶基因，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础。【方法】运用miRNAs芯片技术筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达miRNAs，同时运用miRNAs特异的引物组对差异表达的miRNAs进行荧光定量RTPCR验证。运用靶基因预测软件并结合全基因组表达谱芯片结果预测差异表达miRNAs可能调控的靶基因.freeliRNAs芯片结果显示，鼻咽癌中miR-203、miR-503、miR-424、miR-1
2、41和miR-148a表达下调，而miR-25、miR-195和miR-15a表达上调，其差异表达均在2倍以上；荧光定量RTPCR结果与miRNAs芯片的结果较符合；其中miR-203的预测靶基因为CG1和SPARC，ethods】MicroRNAmicroarrayiRNAsinprimaryNPCcells,andthediscoveredmiRNAsedbyrealtimeRT-PCRassay.Furthermore,sandtheefromprimaryNPCcells.icroRNAmicroarrayshoiR-203,miR-503,miR-424,miR-141,andm
3、iR-148aaryNPCcellsbytiR-25,miR-195,andmiR-15aorethantrealtimeRT-PCR.CG1andSPARC,thepredictedtargetgenesofmiR-203,.freelaryNPCcellsbyiR-203,miR-503,miR-424,miR-141,miR-148a,miR-25,miR-195,andmiR-15aiR-203,mayplayanimportantroleinthepathogenesisanddevelopmentofNPC.miRNAs(microRNA)是一类高度保守的非编码小RNA（nod
4、-codingsmallRNA），一般为19～25nt的单链型RNA，由60～110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。它们广泛存在于植物、动物以及病毒中1。miRNA与靶mRNA的3’UTR碱基配对，通过抑制mRNA的翻译2或直接使mRNA降解3，在转录后水平使基因产生沉默。越来越多的证据显示由miRNA调节的基因调控机制作为基因表达水平调控的一种重要方式，与肿瘤的发生密切相关，miRNAs很可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因。对慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia,CLL)的研究发现mir-15a和mir-16-1位于13q14染色体缺失域，5
5、0%～60%的CLL的患者存在mir-16-1和/或mir-15a的表达下调4，而miR-143和miR-145在结肠癌中表达下调5，Let-7在肺癌细胞中表达下调，RAS可能受到Let-7的调控6，并且50%以上的miRNAs的基因位于在人类癌症中发生缺失、扩增的染色体区域或染色体脆性位点，进一步表明了miRNAs与人类癌症的相关性7。鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma,NPC）是我国南方地区常见的恶性肿瘤。目前认为，遗传因素、EB病毒感染和某些环境因素与鼻咽癌的发生有关８，但具体的分子发生机制尚不清楚。本研究应用miRNAs芯片筛查了原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细
6、胞差异表达的miRNAs，并在对差异表达的miRNAs进行靶基因的预测的基础上进一步对其靶基因进了行验证，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础。1材料和方法1.1材料5例原代培养鼻咽癌细胞（NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47）及5例原代培养鼻咽正常上皮细胞（NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13）标本均来源于中山大学肿瘤防治中心鼻咽科门诊。患者均为未接受过治疗的门诊病人。鼻咽癌细胞株C666由中山大学附属肿瘤防治中心实验研究部冻存。1.２方法1.２.1细胞培养鼻咽原代细胞的培养方法参见文献１，其中用于芯片的鼻咽原代细胞均经过生物学特
7、性的鉴定（资料未发表）。C666细胞用RMPI1640培养基（含有10%的FBS、50mg/L链霉素和50mg/L青霉素），细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中。1.２.２小分子RNA样品的分离与荧光标记取对数生长期细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，异丙醇沉淀法浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量。取50～100μg总RNA用miRNAIsolationKit分离小于100n
