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时间:2018-11-20
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1、差异表达基因的几种筛选方法论文【关键词】mRNA差异显示;基因表达;DNA微阵列【摘要】多种因素导致的基因差异性表达与疾病的发生发展密切有关,分离差异表达基因,对于研究细胞生命过程的调节机制及致病机制具有重要意义.20世纪90年代以来,先后出现了mRNA差异显示PCR(mRNADDRTPCR)、代表性差异分析(RDA)、抑制性消减杂交(SSH)、基因表达连续性分析(SAGE)和DNA微阵列(DNAmicroarray)等多种分析差别表达基因的方法.我们对以上方法的原理、基本步骤及其应用进行简要综述.【关键词】mR
2、NA差异显示;基因表达;DNA微阵列0引言随着各类基因组计划的相继完成,人类面临的更艰巨的任务是研究基因功能活动,也就是说基因组序列分析仅仅代表了遗传信息复杂性的一个层次,而遗传信息有序地、时相地表达则是决定生物体及其行为的另一个层次.所以,发现不同生物体及其组织在各种状态下(正常状态、发育、衰老、损伤及疾病)差异表达的基因具有十分重要的意义.freelRNA的丰度高低及有无进行比较.差异表达基因有两个含义,即表达基因的种类变化和基因表达量的变化.传统的基因分析方法如Northern杂交、斑点杂交等存在费时、费力
3、的缺点,已不适宜进行大规模基因表达分析研究的需要.因此随着分子生物学的发展,出现了大量新方法,按其技术特点可分为三类:①以杂交为基础的技术,包括Northernblotting,Slmapping/Rnase保护、抑制性消减杂交和DNA微阵列;②以PCR为基础的技术,如差异显示PCR(DDPCR)、代表性差异分析(RDA);③以测序为基础的技术,如表达序列标签(EST)、基因表达连续性分析(SAGE)等.我们对目前主要的差异表达基因的筛选方法作一综述.1mRNA差异显示PCR(differentialdispla
4、yPCR,DDPCR)mRNA差异显示PCR又称为差别显示反转录PCR(differentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRTPCR).DDRTPCR技术[1-3]最早于1992年出现,可以用于分离在不同的真核细胞中差异表达的cDNA并加以克隆.其原理是将两种细胞的mRNA逆转录后进行PCR扩增.PCR3′端引物序列是针对mRNA的poly(A)尾设计的,一般是11个T再加上两个碱基,这样12种3′端引物(T11AA,T11AC,T11AG,T11AT,T11CA,T11G
5、A,T11CC,T11CG,T11CT,T11GC,T11GG,TT11GT)就可以与所有mRNA的poly(A)尾匹配;5′端引物是随机引物,一般为10个碱基,因此产生一些不同长度的cDNA片段,电泳后比较两者的差别而得到差异表达基因的cDNA.但这个方法存在许多严重的缺陷,它的5′端随机引物一般常有2~3个碱基不能与cDNA模板完全匹配,而且PCR反应中随机性、偶然性比较大,容易形成非特异性扩增而造成高的假阳性率,这就使下游的筛选工作很巨大.理论上此方法可以检测到95%以上的转录体,但由于引物序列的随机性和竞
6、争性模板结合位点的存在,很难确定实际的原始RNA丰度.尽管有上述缺陷,但由于其实验步骤较简单,此方法在实际工作中应用仍较多,例如用于筛选在肿瘤发生、愈伤过程以及胚胎植入过程中起重要作用的基因等.2代表性差异分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)RDA[4-8]是Lisitsyn等于l993年在差减杂交的技术基础上发展的分析基因组DNA差异的方法,Hubank等于l994年对其作改良后用于cDNA的分析.该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法[9],主要步骤包
7、括:①将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA片段群,接上接头进行第1次PCR扩增;②将testercDNA和drivercDNA用限制性内切酶酶切,形成平均长度256bp的cDNA;③将接头消化,在testercDNA末端接上新的接头,testercDNA和drivercDNA按1∶100比例混合.过量的divercDNA可与testercDNA中互补的部分形成双链;④复性,以新接头为引物进行第2轮PCR.三种杂合体中只有自身退火形成的tester/tester杂合体才能和引物配
8、对,并以指数形式扩增;tester/driver杂合体只能是线性递增;而driver/driver杂合体则无法扩增.该方法的主要优点就是能够使差异表达的基因高度富集,重复性较好,假阳性少.利用RDA人们已经发现了多个新基因.如白血病凋亡相关基因TFAR19,人乳腺癌相关基因TSPS0等.Arava等[10]利用RDA分析了胰腺β细胞和α细胞,发现26个基因在β细胞中高表达
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