轮状病毒非结构蛋白4的克隆、表达及其对细胞损伤作用的初步研究

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1、万方数据答辩委员会成员：搂丞基麴援湿划匡型太堂万方数据温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10目U吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．10第一部分轮状病毒寻E结构蛋白4的表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯13一材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13二结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21三分

2、析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24第二部分NSP4蛋白的诱导表达及纯化鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27一材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27二结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32三分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．34第三部分RVNSP486-175蛋白对细胞损伤作用的初步研究⋯⋯⋯⋯37一材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37二结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40三分析讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯．．44全文小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48中英文缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯65万方数据温州医科大学硕士学位论文轮状病毒非结构蛋白4的克隆、表达及其对细胞损伤作用的初步

4、研究中文摘要目的本课题构建轮状病毒(Rotavirus，RV)非结构蛋白4(Nonstmcturalprotein4,NSP4)及其第86-175aa(86to175aminoacidpeptideofnonstmcmralprotein4,NSP496-175)基因的原核表达系统，通过转化EcoliBL21(DE3)、IPTG诱导表达、Ni．NTA亲和层析纯化等方法制备重组蛋白。分析NSP4对Caco一2细胞和原代培养的SD大鼠神经元细胞的损伤作用，进一步探讨RV对肠外细胞的损伤机制。方法1．构建pET．28“+)．NSP4和pE

5、T．28a(+)-NSP496一175表达载体胶体金法筛选A群轮状病毒阳性粪便，提取总RNA逆转录为cDNA，PCR扩增出目的基因NSP4和NSP486．175，将目的基因与pMDl9．Tsimplevector连接，转化EcoliDH5a感受态细胞，经菌落PCR和质粒酶切鉴定后送DNA测序。提取pMDl9T-NSP4、pMDl9T-NSP486．175和pET-28a(+)质粒分别进行双酶切，T4DNA连接酶连接并转化EcoliBL21(DE3)感受态细胞，菌落PCR、质粒酶切鉴定及DNA测序后应用于后续试验。2．NSP4诱导表达

6、和纯化根据不同口TG浓度和诱导时间分别对含有pET．28a(+)-NSP4和pET．28a(+)．NSP486．175的EcoliBL21(DE3)进行诱导表达，分析最佳诱导条件。收集菌体沉淀，高压破碎，SDS．PAGE分析蛋白的表达方式及表达量。破碎后的上清进行Ni-NTA亲和层析纯化，脱盐柱脱盐。取部分纯化蛋白进行SDS—PAGE分析和Westernblot鉴定。3．RVNSP486’175蛋白对Caco一2细胞胞内游离钙离子(intracellularfreeCa2+，[Cap】i)干扰作用用PBS溶解重组蛋白，Bradfor

7、d法检测蛋白浓度。PBS作为阴性对照，Fluo．3标记Caco-2细胞[Ca2+】i，激光共聚焦显微镜检测NSP486_175对[Ca2+]i的干扰。4NSP4s6—175蛋白对神经元细胞的损伤作用分离培养出生24h的SD大鼠神经元细胞。用不同浓度的NSP486-175刺激成熟的神经元细胞，12h后倒置显微镜下观察细胞状态。收集细胞培养液检测LDH万方数据温州医科大学硕士学位论文活力，激光共聚焦显微镜观察添加蛋白前后神经元细胞[ca2+】i荧光强度和分布改变。结果1．构建pET一28a(十)一NSP4和pET一28a(+)一NSP4

8、s6一175表达载体PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，分别在500bp和300bp左右有预期大小的条带。pET-28a(+)-NSP4和pET．28a(+)-NSP486．175表达载体分别经NcoI、XhoI和NcoI、HindI