猪瘟病毒quantigene viewrna原位杂交方法的建立及初步应用

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1、独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容，也不包含为获得中国兽医药品监察所或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：赴舷20l噜年6月l。Et关于论文使用授权的说明本人完全了解中国兽医药品监察所有关保留、使用学位论文的规定，即：中监所有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采

2、用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国兽医药品监察所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：越燕、导师签名：时间：钿l印年5月jo目时间：如，9年多月，口目中国兽医药品监察所硕士学位论文摘要猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVLrUS，CSFV)引起的猪的高度接触性、致死性传染性疾病，给养猪业造成巨大威胁和经济损失。本研究建立了CSFVQuantiGeneViewRNA原位杂交检测方法；并采用建立的CSFVQuantiG

3、eneViewRNA原位杂交方法初步应用于CSFVRNA在体外感染细胞中的增殖动态研究和体内感染组织的CSFVRNA检测。为了高效检测和准确定位CSFV并探究CSFVRNA在体外感染细胞中的复制动态和分布规律，本研究分别设计并合成了CSFVI斟A和猪内参基因13-actin的多条特异性探针，对培养于PKl5细胞系中的CSFV中等致病力毒株HeBHHl／95(TCID50为1045／2009L)进行研究。并采用正交试验方法优化反应条件，根据检测结果、荧光强度、重复性等因素，确定CSFVQuantiGeneViewRNA原位杂交反应的关键要素，蛋白酶K最优浓度为1：1000，甲醛最优

4、固定时间为30min。在荧光共聚焦显微镜下，阳性样本可检测到明亮的红色荧光。通过与CSFV免疫组化法及CSFV单抗免疫荧光法比较，该法检测灵敏度可达10一，分别比CSFV免疫组化法及CSFV单抗免疫荧光法高4个和3个数量级；同时，采用不同亚型CSFV毒株和猪其它相关病毒质控样本验证其特异性，能特异性与各种亚型的CSFV结合，与其他病毒无交叉反应，显示了良好的特异性。为了研究CSFVRNA在体外感染细胞中的准确定位和增殖动态规律，本研究采用中等致病力流行毒株HeBHHl／95株和HCLV分别接种体外培养细胞PKl5，用上述建立的CSFVQuantiGeneViewRNA原位杂交方法

5、分别对0．5hpi、lhpi、1．5hpi、2hpi、2．5hpi、3hpi、3．5hpi、4hpi、4．5hpi、5hpi、5．5hpi、6hpi、12hpi、18hpi、24hpi、36hpi、48hpi、72hpi、96hpi的感染细胞进行检测，荧光共聚焦显微镜下观察。结果显示，HeBHHl／95和HCLV感染PKl5细胞后，随着感染时间的延长，能观察到病毒在细胞内持续增长繁殖，72hpi达到最高值，直到96hpi病毒RNA一直保持较高水平；；感染后0．5hpi，便可在细胞内检测到病毒RNA，且0．5hpi～12hpi之间，病毒RNA集中在细胞核内，18hpi以后，病毒RN

6、A主要集中于细胞核周围的细胞质中直到96hpi；流行毒株和疫苗毒株RNA的复制规律是一致的。本研究第一次从RNA分子角度阐明了CSFV流行毒株和疫苗毒株在体外培养细胞中的增殖动态和RNA的复制规律。为了准确可视化检测体内感染细胞中的CSFVRNA，本研究采集了CSFV感染动物的扁桃体、肠道和肾脏样本制成石蜡包埋组织切片(FFPE)，使用QuantiGeneViewRNA原位杂交技术对感染后各器官靶细胞中CSFVRNA进行精确检测。结果显示，在荧光显微镜下可观察到点状红色荧光信号，说明建立的CSFVQuantiGeneViewRNA原位杂交方法能准确、可视化地对石蜡包埋组织切片中C

7、SFVRNA进行检测。该研究可为探索CSFV感染靶细胞类型的差异，分析CSFVRNA复制动态、分布变化与病程、病理损伤之间的相关性提供重要的技术平台。本研究成功建立了CSFVQuantiGeneViewRNA原位杂交检测方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和省时的优点，为CSFV准确诊断提供了一种高敏感且特异的新技术；同时为CSFVRNA在体内外靶细胞中增殖动态和RNA的复制规律研究提供重要的技术支持；还可对临床采集CSFVRNA富集样品提出指导意见。关键词：猪瘟病毒RN