猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用

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1、硕士学位（毕业）论文猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用学位申请人：罗尚星指导教师：左玉柱副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：20152200398猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用EstablishmentandpreliminaryapplicationofthedetectionmethodofPorcinedeltaconoravirus学位申请人：罗尚星指导教师：左玉柱副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日

2、期：二〇一八年六月一日本研究由河北省研究生创新项目“猪丁型冠状病毒诊断方法的建立及应用（CXZZSS2017068）”资助。摘要猪丁型冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）是冠状病毒科（Coronavirinae）δ-冠状病毒属的成员，是近年来发现的呈世界性流行的猪肠道病毒病。其临床症状表现为急性腹泻、呕吐、脱水。该病毒首先于2012年在香港被报道，2014年后，该病相继在美国韩国等国家被报道，之后便以暴发的方式在世界范围内发生与流行，对养猪业的健康发展造成了一定的影响。PDCoV的M基因和N基因比较保守，另外有研究表明，PDCoV与P

3、EDV，TGEV的M蛋白抗原间没有交叉性反应性。因此，可以利用PDCoV的M基因和N基因构建检测方法，将为PDCoV防控提供一定的技术支持。本实验室进行了一系列研究：（1）根据GenBank中已发表的猪丁型冠状病毒M全基因序列进行引物设计并合成，M基因经PCR扩增，克隆测序鉴定后的质粒命名为PDCoV-M。根据pET32a载体和M蛋白的特点进行表达引物设计，将pET32a载体与从克隆质粒PDCoV-M中扩增的M基因连接转化构建重组表达质粒pET32a-M并进行诱导，SDS-PAGE检测有与预期相合的50ku左右的蛋白大量表达且蛋白主要存在于包涵体中，利用His标签对p

4、ET32a-M蛋白进行纯化，Western-blotting显示pET32a-M蛋白的反应原性较好。（2）利用纯化的M重组蛋白作为抗原进行了PDCoVM蛋白IgG抗体的间接ELISA检测方法的构建，对反应条件优化和选择的结果显示M重组蛋白的适宜反应浓度为4µg/mL，37℃恒温反应2小时，4℃放置8~12h（或过夜）包被结果更好；采用PBST工作液溶解的脱脂奶粉（5%）进行封闭效果最好，37℃恒温反应1小时；血清和酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000，两者均37℃恒温反应1小时；TMB暗处反应20min最佳。且此方法重复性试验（批内和批间）显示变异系数均

5、不超过10%，与CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV阳性血清间不存在抗原交叉反应，具有较高的重复性与特异性，为PDCoV的大量检测提供了一种适于操作的ELISA诊断方法。（3）利用纯化的M重组蛋白为抗原进行了PDCoVM蛋白IgA抗体的间接ELISA检测方法的构建，对反应条件优化和选择的结果显示M重组蛋白的适宜反应浓度为1.6µg/mL，4℃放置8~12h（或过夜）包被结果更好；采用PBST工作液溶解的脱脂奶粉（5%）进行封闭杂蛋白的效果最好，37℃恒温反应1小时；初乳和酶标抗体的最适稀释度分别为1∶80和1∶50000，两者均37℃恒温反应1小时；TMB暗处反应

6、15min最佳。且此方法重复性试验（批内和批间）显示变异系数不超过10%，与CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV阳性初乳间不存在抗原交叉反应，具有较高的重复性与特异性，为PDCoV的早期检测提供了一种简便的ELISA诊断方法。（4）以10倍梯度稀释的纯化重组PDCoV-M质粒作为标准品模板，建立了一种检测PDCoV的SYBRGreenI荧光定量PCR方法。结果显示，本试验建立的检测方法在101拷贝·μL-1至107拷贝·μL-1之间线性关系均较好，相关系数R^2为1.00，扩增效率E在99%以上，检测灵敏度为53拷贝·μL-1，且与PEDV、TGEV、PRV、PC

7、V2病毒的DNA均无交叉性反应，特异性较高；组内变异系数小于1.52%，组间变异系数小于3.15%，重复性较好，为PDCoV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。（5）通过GenBank登录的PDCoVN基因的序列设计了一组LAMP引物，所用的反应模板为pMD19T-N重组质粒，以羟基萘酚蓝为显色剂，通过对反应温度，反应物浓度等进行优化，构建了一种可直接观察结果的检测PDCoV的LAMP检测方法，并对其进行了特异性试验和灵敏度检测。结果表明，该方法特异性较好，与PEDV、TGEV、PRV、PCV2的DNA间均不存在交叉性反应；该方法灵