激素剂诱导的β-arrestinl核转位及其机制的研究

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1、复旦大学硕士学位论文激素剂诱导的β-arrestinl核转位及其机制的研究姓名：苏文娟申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：马兰20030526皇里盔兰堡主芏垡芝苎—————一塑垫型受量盟Q：!!堡!!!!!堕整垡丞基垫型塑堑壅缩写词GPCR(Gproteincoupledreceptor)，G蛋白偶联受体DOR(8-opioidreceptor)，6-阿片受体WT，野生型6_5可片受体A31，缺失羧基末端31个氨基酸残基的DOR突变体M3，含T358～T361～S363G的磷酸化位点被取代的DOR突变体GRK(

2、Gproteincoupledreceptorkinase)，G蛋白偶联受体激酶MOR(p．-opioidreceptor)，g-阿片受体KOR(K—opioidreceptor)，K一阿片受体132AR(p2-adrenergicreceptor)，B2肾上腺素受体NES(nuclearexportsignal)，核输出信号／3-arrestin，parr一13arrl-2CT—GFP，由入p—arrestinl的N端333个氨基酸(1-333)和人p．arrestin2的羧基末端73个氨基酸(336．408)组成的

3、B．arrestin嵌合体。parr2—1CT·GFP，由人D·arrestin2的N端335个氨基酸(1-335)和人13．arrestinl的羧基末端85个氨基酸(334．418)组成的B．arrestin嵌合体。13arrlN，13arrl的N端片段(I]arrl氨基酸残基1-184)Darr2N，Barr2的N端片段(fhrr2氨基酸残基l-186)6町1C，parrl的c端片段(parrl氨基酸残基185—418)parr2c，13art2的C端片段(parr2氨基酸残基186—408)HEK，人胚肾细胞GF

4、P,绿色荧光蛋白2!燮堂堡主堂垡堡奎塑垫型重量盟旦：璺壁!墅!垫整垫墨苎垫型塑堑室中文摘要G蛋白偶联受体(GPCR)是一类重要的细胞表面受体，通过G蛋白传递信号。p—arrestin(parr)是一类重要的信号调控蛋白和支架蛋白(scaffold)，在GPCR的信号转导和调控中起重要作用。在激动剂的作用下GPCR激活G蛋白介导的信号通路并发生磷酸化和内吞。parr选择性地同磷酸化的GPCR结合、引起受体内吞而抑制受体的信号转导，并能作为支架蛋白结合其它信号分子易化细胞内其它信号通路的激活。Darr有两种亚型，Darrl

5、和parr2，两者的结构具有很高的同源性，在调控GPCR信号转导中的功能也很相似。研究表明，在激动剂的刺激下parrl和parr2从细胞浆向GPCR所在的细胞膜转位，与磷酸化的GPCR结合、参加GPCR的信号转导和调控。但是随着研究的深入，parrl和parr2之间的差异逐渐被发现，研究结果提示parrl和parr2对GPCR信号的调控机制存在差异。此外，最近的研究发现两者在细胞内的分布也有差异，flarrl分布于胞浆和胞核而flarr2只分布在细胞浆中。很多研究证明Darr在GPCR激活后发生的细胞内重分布，即从细胞

6、浆向细胞膜的转位对其功能有重要影响。但parrl和parr2在亚细胞分布的不同是否与parrl和parr2的功能有关以及其生物学意义目前尚未有任何报道。因此，本课题在HEK293细胞上，使用Barr—GFP融合蛋白研究了GPCR激活后Darrl和Barn在细胞内的重分布及其机制并对其相关功能进行了初步的探讨。我们的研究结果表明：(1)激活6一阿片受体能诱导parrl向细胞核转位，但在相同条件下未观察到Barr2能向细胞核转位。(2)激活KOR也可以引起parrl向细胞核转位。而MOR和B2AR被激活后，parrl只向细

7、胞膜转位但未观察到其向核转位，说明一些GPCR的激活可以引起13arrl发生核转位和膜转位，而另一些受体只能引起13arrl向细胞膜转位。(3)进一步研究发现受体的C末端对激动剂刺激的parrl核转位有重要影响。激活缺失羧基末端最后31个氨基酸的DOR突变体△31不能诱导parrl向细胞核转位。激活DOR突变体M3(磷酸化位点突变体)和E355Q／D364N(GRK结合位点突变体)都不能刺激parrl向核转位。这些结果提示激动荆刺激的Oarrl核转位依赖于激动剂诱导的GRK催化的受体的磷酸化。(4)我们在HEK293细

8、胞中瞬时表达了parr嵌合体，观察发现，与Darr2相同，C末端被换成相应的parr2片段的Da玎l突变体parrl-2CT—GFP主要分布在胞浆，在激动剂刺激下不发生向细胞核的转位。而C末端被换成相应的parrl片段的Darr2突变体pa玎2．1CT．GFP则表现出与parrl相同的分布特征，均匀地分布3墨旦2三兰

9、苎堡主堂垡堕