细胞色素p450 2c19稳定表达细胞系的构建及其在中药筛选中的初步研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文细胞色素P4502C19稳定表达细胞系的构建及其在中药筛选中的初步研究姓名：陈旺申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：周宏灏201205重庆医科大学硕士研究生学位论文细胞色素P4502C19稳定表达细胞系的构建及其在中药筛选中的初步研究摘要目的：CYP2C19是细胞色素P450家族中重要的一类代谢酶，参与了众多临床药物的代谢。本研究利用体夕bDNA重组技术、克隆构建CYP2C19野生型载体及2个突变型载体，并表达于人肝癌细胞(Hep92)，建立稳定表达目的基因的稳转细胞系，建立一个研究CYP2C19酶活性的高通量荧光检测技术平台。主要进行酶动力学分析以及药物抑制

2、高通量筛选，测定酶动力学常数和药物抑制常数，体外研究细胞色素CYP2C19基因多态性外对药物代谢的影响。为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。方法：提取人肝脏组织中mRNA，应用RT-PCR法从人肝脏cDNA文库中扩增出CYP2C19野生型基因(CYP2C19*I)序列，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3．1(一)，再以此为模板，体外定点突变PCR法构建术2、术3(突变型)载体，经菌落PCR，酶切以及测序鉴定后，经脂质体转染HepG2细胞，通过G418选择培养，建立稳定转染细胞系，RT—PCR，Wester

3、n—Blot分别检钡UCYP2C19SNPsmRNA以及蛋白的表达。以CEC(3-cynao-7一ethoxycoumarin)作为CYP2C19特异性荧光底物进行酶学反应，检测CYP2C19SNPs活性，使用非线性回归方法计算酶促反应动力学参数Km值，Vmax值和内在清除率CLint值(Vmax／Km)。通过将特异性荧光底物CEC(浓度选取在Km值附近)，待检测中药单体重庆医科大学硕士研究生学位论文(浓度梯度从128至UluM等比稀释)，以及其他用来模拟体内环境的相关实验条件相组合进行体外酶抑制反应，分析待检测中药单体对CYP2C19SNPs的抑制效应，并计算其IC。。值。本实验初步对

4、105多种中药单体进行了初步筛选，并从中选取22种中药单体进行了深入研究。结果：RT—PCR显示目的基因CYP2C19各SNP扩增良好，筛选的HepG2细胞系中均有各目的基因的表达，同时，western—blotting印迹显示CYP2C19SNPs在该系统中得到了稳定的表达，成功获得了目的基因的表达蛋白。使用特异性荧光底物CEC直接与细胞孵育进行酶动力学反应，CYP2C19*I代谢CEC的酶促反应动力学参数Km值为17．3±1．093，Vmax值为86．8±4．518，CLint值为4．945±O．132；CYP2C19．2Km值为19．62±1．384，Vmax值为17．24±2．3

5、64，CLint值为0．847±0．086；CYP2C19*3Km值为15．21±2．271，Vmax值为9．93±0．479，CLint值为0．671±0．059。本实验所得数据与已有研究报道结果相近。将CEC浓度固定在其l(m值附近，采用细胞直接孵育法与CYP2C19已知特异性抑制剂反苯环丙胺系列浓度共同孵育，结果验证反苯环丙胺对CYP2C19*I有特异性的抑制作用，IC50约为7．73uM。运用荧光高通量检测技术对多态性等位酶和大约100种中药单体的抑制筛选实验表明：2C19参与代谢的底物和己知抑制剂均对其有抑制作用，多数中药单体对CYP2C19抑制作用微弱或者无抑制作用；化学结构

6、或治疗作用类似的同类药品对CYP2C19的抑制情况不一；不同基因型被同一种药物抑制程度也不尽相同，甚至差别较大。结论：1、本研究成功建立TCYP2C19体外稳定表达的细胞系，目的基因蛋白活性良好且表达稳定。2、测定验证了CYP2C19多态性体外药代动力学活性以及众多中药单体对其抑制作用的初步研究。3、建立了高效、稳定、简便的荧光高通量药物筛选平台，为后期研究CYP2C19重庆医科大学硕士研究生学位论文应用于创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测奠定了基础，为临床潜在药物相互作用提供前期实验依据。关键词：细胞色素P4502C19：基因多态性：荧光检测技术：酶动力学分析：药物高通

7、量筛选重庆医科大学硕士研究生学位论文CoNSTRUCTINGSTABLEEXPRESSIONCYToCHRoMEP4502C19CELLLINESANDITSPRELIMINARYSTUDYINTHESCREENINGoFTRADITIONALCHINESEMEDICINEINVITROABSTRACTAims：CYP2C19isanimportantmetabolicenzymeincytochrorneP450familyand