FBXO6稳定表达肿瘤细胞系的构建及其亚细胞器定位-论文.pdf

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1、第9卷第6期中国科技论文Vo1．9No．62014年6月CHINASCIENCEPAPERJun2014FBXO6稳定表达肿瘤细胞系的构建及其亚细胞器定位刘彬，徐含章，崔佳毅，苏绪波，陈国强(上海交通大学医学院病理生理学教研室，上海200025)摘要：检测FBXO6在多种肿瘤细胞中的表达和定位情况并构建稳定表达FBXO6的肿瘤细胞株。运用RT-PCR方法，在人胚肾293T细胞以及9种不同来源的肿瘤细胞中，检测了FBXO6的表达情况。以载体质粒pBabe-3Flag-FBXO6一puro／pBabe-3Flag-con、

2、包装质粒pCMV-GAPOL及包膜质粒pCMV-VSVG用Lipofectamine2000共转染包装细胞系293T，收集病毒颗粒感染A549细胞，经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株，Westernblot鉴定FBXO6的表达。利用激光共聚焦荧光显微镜，采用间接免疫荧光方法，检测外源性FBXO6在A549中的亚细胞定位。在1O种不同来源的细胞株中，FBXO6在A549细胞中的表达最高。成功筛选出嘌呤霉素抗性细胞系A549一Con与A549—3Flag-FBXO6。Westernblot方法发现A549—3Flag-FBXO6

3、细胞系稳定表达FBXO6蛋白。间接免疫荧光发现FBXO6与内质网tracker有共定位。FBXO6在肺癌A549细胞中高度表达，构建了稳定表达FBXO6的A549细胞系，部分FBXO6分布在内质网中。关键词：病理生理学；FBXO6；逆转录病毒载体；内质网；A549细胞中图分类号：R363．2文献标志码：A文章编号：2095—2783(2014)06—0696—03TheconstructionofcancercelllinesstablyexpressingFBXO6anditssubcellularlOcalizat

4、ioninA549cellsLiuBin，XuHanzhang，CuiJiayi，SuXubo，ChenGuoqiang(DepartmentofPath0phystot0g，ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine(SJTU-SM)，Shanghai200025，China)Abstract：TheexpressionandlocalizationofFBX06inavarietyoftumorcellshasbeendetected，andatumorcel11inest

5、ablyex—pressingFBX06hasbeenconstructedinthispaper．TheexpressionofFBXO6wasexaminedbvRT—PCRmethodinbothhumanembryonickidney293Tcells，andninekindsoftumorcellsfromdifferentsources．Packagingcellline293Twasco-transfectedwithpBabe-3Flag-FBXO6puro／pBabe~3Flagcon，packagi

6、ngplasmidpCMV-GAG-POLandenvelopeplasmidpCMV-VSVGbyLipofectamine2000．VirusparticleswerecollectedandA549cellswereinfected．Cellswereselectedbypuromycintogetstablyexpressingstrains．WesternblotwasusedtOdetectFBXO6expression．Laserconfocalfluorescencemicroscopyandindir

7、eetim—munof1uorescencewereusedtOdetectthesubcellularlocalizationofexogenousFBX06inA549cells．A549cellsexpressedthehighestFBX06amongthe10differentsourcesofcelllines．Puromycin-resistantcell1inesA549一ConandA549—3Flag-FBXO6wereselected．A549—3Flag—FBX06stablyexpressin

8、gFBXO6proteinwasconfirmedbyWesternblot．Indirectimmunofluores—cencefoundthatFBXO6wasco-localizedwithendoplasmicreticulumtracker．FBX06washighlyexpressedinlungcancerA549