白鲢细胞色素P450(CYP3A137)的克隆及其表达研究.pdf

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1、CLONINGANDEXPRESS10NDETERMINATIONOFCYTOCHROMEP4503A137GENECOMPLEMENTARYDNAINSILVERCAI冲ADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByMaJunguoSupervisor：Prof．LiXiaoyuMay

2、,2013摘要细胞色素P450是一类含有亚铁血红素的超家族单加氧酶，它参与许多外源物质(包括药物、环境化合物等)和内源性物质(如激素)的代谢转化。CYP3A是I相解毒酶系CYP450家族中的重要成员，在肝脏对外源毒物解毒和内源激素的代谢过程中发挥重要作用。本研究克隆了白鲢肝脏CYP3A137基因，并检测了利福平、毒死蜱和离子液体对其表达的影响。本研究中克隆了白鲢CYP3A137cDNA全序列，构建了CYP3A系统发育树，结果表明，白鲢CYP3A137氨基酸序列与其它鱼的CYP3A序列高度相似。生物信息

3、学分析结果显示，白鲢CYP3A137cDNA序列全长1810bp，开放阅读框1539bp，编码513个氨基酸。CYP3A137蛋白质分子量为58．7995ku，理论等电点为7．96。该蛋白是一个稳定蛋白并具有一定的亲水性。二级结构预测可知，CYP3A137包含45．22％的a．螺旋、12．28％的延伸链，4．29％B．折叠和38．21％的无规则卷曲。具有2个显著的跨膜结合区。组织学分布检测结果显示，CYP3A137基因在白鲢的肝脏、肾脏、脾脏、脑、心脏、小肠、肌肉都有表达，表达量高低依次为肝脏>小肠>

4、。肾脏>脾脏>脑>心脏>肌肉。利福平对白鲢的毒性结果表明，以50mg·Kg。和200mg·Kg。1利福平腹腔注射白鲢，均能诱导白鲢肝脏CYP3A137基因表达，且通过红霉素．N．脱甲基法检测50mg·Kg。1处理组在24h即能使CYP3A酶活性升高，200mg·Kg。1处理组在72h时CYP3A酶活性极显著高于对照组。结果表明，利福平能诱导白鲢肝脏CYP3A137表达。毒死蜱对白鲢的急性毒性结果表明，毒死蜱对白鲢属于高毒，96hLC50为0．172mg·L～。根据半致死剂量选取0．017mg‘L’1(

5、1／1096hLCso)和0．103mg。L。(3／596hLC50)浓度组毒死蜱暴露白鲢，24h后取肝胰脏，提取RNA，通过荧光定量PCR检测CYP3A137基因的表达情况，结果表明毒死蜱对白鲢的CYP3A137基因表达有明显抑制作用。离子液体『C8mim]Br对白鲢的急性毒性结果表明，离子液体对白鲢属于低毒，72hLCso为218．52mg·L～。根据半致死剂量选取22mg‘L。(1／10LCso)和109mg·L‘1(1／2LCso)浓度组『C8mim]Br对白鲢染毒，24h、72h取肝胰脏，提

6、取RNA，通过荧光定量PCR检测CYP3A137基因的表达情况，通过红霉素．N．脱甲基法检测CYP3A酶活性。结果表明，[C8mim]Br对白鲢的CYP3A137基因表达水平有明显的诱导作用，且能使CYP3A酶活性升高，[C8mim]Br可能是CYP3A137的作用底物。关键词：白鲢，CYP3A，序列分析，利福平，毒死蜱，离子液体IIABSTRACTCytochromeP450(CYPs)enzymesaremembersofthehemoproteinsuperfamily，andtheyarein

7、volvedinthemono-oxygenationreactionsresponsibleformetabolismofvariouskindsofendogenousandexogenouscompounds，suchaschemicals，drugs，hormonesinmammals．CYP3AisanimportantmemberofCYP450andplaysakeyroleinthedetoxificationoftoxicants．Thepresentstudyaimstoclone

8、CYP3A137fromthehepatopancreasofsilvercarpandtodetermineitsexpressionatmRNAlevelwhenthefishisexposedtOrifampicin，chlorpyrifosorionicliquidsAfull-lengthsequenceofCYP3A137eDNAinsilvercarpwasclonedandsequenced，andthenaphylogenetictre