bacillus+sp.c3细胞色素p450%3acyp102a16基因的克隆、优化表达及其酶性质研究

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1、浙江大学硕士学位论文Bacillussp.C3细胞色素P450：CYP102A16基因的克隆、优化表达及其酶性质研究姓名：李泽莉申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：周启发；赵宇华201201浙江大学硕士学位论文摘要细胞色素P450(cytochromeP450或CYP450，简称P450)是在生物界内广泛分布的一类血红素蛋白超家族末端加氧酶，主要参与内源性物质和外源性物质的代谢作用。P450是生物界中最具催化多样性的生物催化剂，能催化许多结构不同的物质发生羟基化、环氧化、脱烷基化、脱氨、脱氢、脱卤素等反应，使许多难降解化合物转化为可生物降解物质。因此，P450在环境污染物的修

2、复治理方面的应用探索成为近年来的一个研究热点。本论文从实验室保存的一株芽孢杆菌Bacillussp．C3中分离克隆到了一新型细胞色素P450基因：CYPl02A16，构建了该基因的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中成功表达，通过发酵条件优化提高酶的活性表达量，经亲和层析纯化获得CYPl02A16纯酶，并对该酶的各项酶性质进行了系统的研究。论文的主要研究结果如下：1)CYPl02A16基因的克隆与表达利用简并PCR的方法从Bacillussp．C3菌株中成功克隆到细胞色素P450全长基因并测序，得至1J3198bp的片段，编码1065个氨基酸残基，推测分子量约为120．9kDa。该

3、基因已提交GenBank数据库(FR775424)，由细胞色素P450国际命名委员会(C”ochromeP450NomenclatureCommittee)将其系统命名为CYPl02A16。成功构建表达质粒pET28a(+)．CYPl02A16，并转化E．coliBL21(DE3)，诱导表达的粗酶液经Ni-NTA6xHis．tag亲和层析纯化获得了纯度为84％的CYPl02A16蛋白。该蛋白在SDS．PAGE图谱约119kDa处呈现很浓的条带。2)CYPl02A16酶的发酵条件优化通过单因素实验和统计学的实验设计方法分别对CYPl02A16异源表达的培养条件和发酵培养基组分进行了

4、优化，实现了重组CYPl02A16的高效表达，产量达0．431．tmol·L-l，提高了3．65倍。3)CYPl02A16酶活性及稳定性研究研究了温度、pH、有机溶剂、表面活性剂、金属离子等因素对CYPl02A16酶活性及稳定性的影响。结果发现：CYPl02A16的最适反应温度为35"C，最适反应pH为6．5．7．5，该酶在45"C以下，pH5．0．10．0范围内稳定；CYPl02A16能完全耐受20％DMSO、30％甲醇、10％乙醇和20％丙酮，经10％的乙腈、正丙醇和异丙醇处理后残余酶活在45％以上，浙江大学硕士学位论文摘要经10％的正丁醇处理几乎失活；添加低浓度的CPC(0

5、．003．0．02g'LJ)和TritonX．100(0．1．0．2g-L‘1)可使CYPl02A16酶活分别提高40％和60％左右，低浓度的SDS(O．004．0．008g'Lo)对CYPl02A16的酶活无显著影响；1．20mMK+、20．50mMNa+、O．05mMCd2+对CYPl02A16酶活表现轻微促进效应，Nrh+、Ca2+、M92+、Fe”、cd+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和EDTA均能不同程度的抑铜JCYPl02A16的活性。4)CYPl02A16酶的稳态动力学研究CYPl02A16对中长链脂肪酸有偏好性，对不饱和脂肪酸的结合力强于饱和脂肪酸，伴随饱和脂肪酸

6、碳链的增长，KD值增大，结合强度减弱。CYPl02A16对软脂酸的亲和力最强(Km=lO．1¨M)，其对饱和脂肪酸(除软脂酸外)的‰明显高于不饱和脂肪酸。该酶对各脂肪酸的催化转化效率(K砒)相对较低，约在110～580min"1范围内。5)CYPl02A16酶的底物谱分析以29种P450酶的潜在底物为对象，对CYPl02A16进行了底物谱分析。结果发现：除了天然底物中长链脂肪酸外，CYPl02A16还对短链脂肪酸(

7、价值。关键词细胞色素P450：CYPl02A16；Bacillussp．C3：优化表达；环境修复III浙江大学硕士学位论文AbstraetAbstractCytochromeP450s(P450sorCYPs)，asamonooxygenasesbelongtothelargefamilyofhemoproteins，are诚delyexistedandplayanimportantroleinthemetabolismofendogenoussubstancesandxenob