大鼠肝微粒体细胞色素p450酶活性研究方法概括

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1、大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性研究方法概括陈焕文（上海市普陀区中心医院药剂科201203）【摘要】目的：综述大鼠肝微粒体中细胞色素CYP450活性研究方法。方法：查阅国内外文献，对肝微粒体CYP450进行介绍，并总结和归纳中药在CYP450酶活性研究方法的应用。结果：CYP450研究方法主要包括体外实验：CO吹泡法，化学显色法，体外温孵和体内cocktail探针实验。该方法的应用从中药单体成分逐渐发展到中药提取物、中药复方。结论：随着科研水平的提高，体外方法对CYP450研究越来越深入，合体内cocktail探针

2、法，提高药物体内代谢清除预测的准确性。【关键词】中药P450酶肝微粒体温孵cocktail探针中药，具多成分的特点，每一味中药均含有大量的化学成分，在中医药理论指导下，遵循整体辩证论治的原则进行研究及治疗。近十几年来，中药在细胞色素P450方面的应用越来越广泛和深入，不仅仅局限于单体对P450酶活性的影响，后还有单味药作为研究对象，发展到现在，中药复方对P450酶的研究越来越受到海内外学者的关注。体现了中药不仅局限于传统的应用技术上，还不断的融合于新技术、新思维、及新的领域，为更进一步的了解中药多成分，多靶点，多效应

3、的理论基础开创新的依据。一、细胞色素P450酶的简介细胞色素P450酶是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和内源性的物质代谢中起着极其重要的作用，并引起自身或其他药动学的改变,使得药效增强或减弱，而导致药物中毒或无效，药物・药物相互作用的结果，药物对P450酶系活性的影响是药物代谢相互作用最重要的机制。药物代谢酶分I相和II相，细胞色素P450酶（以下简称CYP450或P450）是1相催化多种药物、前毒物、前致癌物等外源性物质的氧化和还原代谢的主要酶类，细胞色素P450是由多种同功酶组成的超大“家族”，与

4、外源性化合物代谢作用有关的约30多种，主要由CYP1、CYP2和CYP3三个族组成，其中CYP1A2,CYP2C9/CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4是最主要的6种亚型，含量约占肝内CYP450酶总量的80%以上且90%以上的上市药物是由这6种亚型代谢的［1-3］o表1阐述了在肝脏中CYP亚型酶个体的相对比例，列举包括底物、抑制剂和诱导剂。众所周知，CYP亚型酶能代谢大多数在结构上有差异的外源性物质，还有很多综述均作了详细的报道［4・刀。表1肝脏中各CYP450亚型的相对含量百分比，探针底物，抑

5、制剂及诱导剂二、P450酶活性方法研究查阅近十年来国内外文献，考察中药对P450酶活性的方法大致归为2类：体外和体内研究方法。2.1体外研究方法肝药代谢酶检测方法中最常用的是肝微粒体法，此法制备简单，代谢时间短，易于重现，方便犬量操作。检测肝微粒体P450酶活性的体外研究方法,大致归为3类：CO吹泡法，化学比色法，体外温孵法。无论采用哪种方法，测蛋白含量是基础和必需的，目前常用测蛋白含量的方法有微量凯氏定氮法，Lowry法⑻及考马斯亮蓝染色法⑼。2.1.1CO吹泡法［10］基本原理：在还原状态下的细胞色素P450可与

6、一氧化碳结合，形成复合物，在波长450nm处出现最大吸收峰，根据峰高测定值的大小计算P450酶的含量。将待测药物对大鼠灌胃数日，后取其肝脏制备肝微粒体，测定蛋白浓度及P450酶含量。该方法是测定P450酶含量最经典的方法，国内大部分学者均是通过测药物对P450酶含量的影响来反映酶活性，因为P450酶活性及其催化能力由酶含量决定，而U此种测酶活性的方法操作简便，指标明确，检测手段多为紫外分光光度仪，条件易满足。如：赵润英等［11］,研究肉豆蔻挥发油对肝脏微粒体细胞色素P450(CYP)、细胞色素B5(Cytb5)、丙二

7、醛(MDA)和血清谷胱甘肽转移酶(GST)的含量；胡锡琴，林飞等［12］研究何首乌、制何首乌以及分别配伍不同剂量茯苓对大鼠肝脏微粒体细胞色素P450酶(CYP450)的影响;韦炳华，宗连柱等［13］研究复方丹参滴丸对大鼠肝微粒体细胞色素P450含量的影响；Kishida,T.;Ataki,H.等［14］研究曲霉发酵过的黄豆粉对大鼠肝微粒体P450酶含量的影响。同样的测酶含量变化来反映酶活性的有葛根素，枳覆子乙酸乙酯提取物，人黄蔥醍衍生物，人参、藜芦^［15-18］；由此可知，测酶含量的方法不仅适用于单体，提取物，同吋

8、对复方的应用亦逐渐尝试，由于酶含量测量指标与药物的成分复杂程度并无直接关系，但不能直接反映药物对具体的亚型酶的活性影响，而仅仅是总P450酶的活性。2.1.2化学比色法基本原理：二甲基亚硝胺主要经细胞色素P4502E1的催化，先进行碳位的瓮化，继而甲醇胺中间产物分解，释放出甲醛，通过Nash比色法以测定甲醛生产量的多少来反应P4502E1的活性