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1、南京农业大学学报1999,22(3):112～114JournalofNanjingAgriculturalUniversity提高富含GC碱基DNA模板PCR扩增效率的方法12邢小黑姜卫红(1南京农业大学资源与环境科学学院,南京210095)2中国科学院上海植物生理研究所,上海200032)MethodofimprovingofpolymerasechainreactionefficiencyforhighGandCDNAtemplate12XingXiaoheiandJiangWeihong1(
2、CollegeofNaturalResourcesandEnvironmentSciences,NanjingAgricUniv,Nanjing210095;2InstituteofShanghaiPlantPhysiology,Shanghai200032)地中海拟无枝菌酸菌U32是一株高产力复霉素的放线菌,其中的pKp基因是U32次生代谢的重要调控信号分子,属蛋白激酶类。研究该基因的结构功能对阐明U32的次生代谢机制具有重要意义。为了首先使该基因在BL21中得到表达,利用PCR方法从克隆有该基因
3、的pCZ8质粒中扩增出pKp基因。由于pKp基因的碱基组成富含GC,因而PCR难度大。本研究通过改善反应体系和扩增条件,获得了大量特异性的PCR产物。1材料和方法111材料质粒抽提试剂盒购自Whatman公司,TaqplusÊ、dNTP购自Sangon公司,引物由TakaRa公司合成,PCR扩增仪为Pharmacia产品。112方法质粒提取根据试剂盒protocol进行,引物根据primerdesign软件包设计,PCR条件在实验中优化,扩增产物电泳后经数字扫描保存。2结果与分析211PCR模板及引
4、物设计分析根据Pcgene软件分析,pKp基因的GC含量可达63%,这是因为U32中密码子在第3位均偏好CG,引物序列如下:primerz1:5′2CCGGAATTCGACCCGCGTTCGGTCGCGA23′primerz3:5′2GACTCAGCATATGGTGCCCCCCTCCAGCGAAGAGACA23′在引物z1的5′端加上EcoRÉ酶切位点和保护碱基,长度为28bp,GC含量为6%,Tm=99°C。在引物z3的5′端加上NdeÉ酶切位点和保护碱基,长度为37bp,GC含量为59%,Tm=
5、98°C。[1]根据引物设计的原则,引物的有效长度Ln=2(G+C)+(A+T)≤38。以上两个引物有效长度均大于38,且Tm值已高于标准的上限80°C,因而大大增加了PCR难度。212通过改变PCR扩增条件提高PCR特异性产物量[2]Chouljenko以富含GC的DNA为模板进行PCR扩增时,采用了高温复性的条件,获得了313kb的特异PCR产物。本试验中,95°C预变性5min,95°C变性3min,90°C退火1min,72°C延伸10min,共扩增14个循环,当扩增至第10个循环时,补充T
6、aq酶。反应体系中含水40LL、模板DNA015LL、引物各收稿日期:1998209215第3期刑小黑等:提高富含GC碱基DNA模板PCR扩增效率的方法1131LL、dNTP115LL、buffer5LL、TaqplusÊ1LL,总体积为50LL。PCR产物电泳结果(图1),除了在119kb的一条特异性带外,在017kb处仍有一条非特异性带。为了获得单纯的特异性PCR产物,改变PCR扩增条件,即95°C预变性3min,95°C变性1min,92°C退火1min,72°C延伸13min,共扩增20个循
7、环,当扩增至第10个循环时,加入TaqplusÊ5LL,PCR产物电泳图谱如图2。很显然,将退火温度从90°C升至92°C,非特异性带消失,只剩下119kb的特异性带。在预试验中发现,当退火温度为68°C时,PCR产物的电泳图谱上未发现dimer,且泳道上有核酸背景(图谱未显示),推测属极其大量的非特异性产物的存在。而将退火温度提高至90～92°C时,可得到特异性PCR产物。图190°C复性的PCR扩增产物电泳图图292°C复性的PCR扩增产物电泳图Fig.1PCRamplificationprod
8、uctsat90°CdenatureFig.2PCRamplificationproductsat92°Cdenature(1.1kbmarker;21PCRproducts)(1.PCRproducts;2.1kbmarker)213甘油对提高PCR扩增效率的效果提高退火温度虽然能得到特异性PCR产物,但扩增时间长达6～7h,且中途须补加一次酶。为了缩短PCR扩增时间并提高PCR扩增效率,在PCR扩增体系中加入了DMSO甲酰胺和甘油。其PCR产物的电泳图谱见图3。在
