斜纹夜蛾细胞spli apaf-1蛋白在细胞凋亡过程中作用机制的初步研究

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1、分类号——UDC——密级——编号——每·If埽黪夯零硕士学位论文学位申请人姓名：壑盘堑申请学位学生类别：一．全堕刿塑±申请学位学科专业：盔些垦塞鱼皇塞堕鲎指导教师姓名-一一一丝．童盘趱⑧M⋯ASTE⋯R'STHE粥硕士学位论文IIIIII]IIIllllllHI]1IllIY2556536斜纹夜蛾细胞SpliApaf-1蛋白在细胞凋亡过程中作用机制的初蜘开究论文作者：赵婧妍指导教师：彭建新教授学科专业：农业昆虫与害虫防治研究方向：细胞分子生物学华中师范大学生命科学学院2014年5月硕士学位论文MASTER’STHESISPrimarystudytothemechan

2、ismofSpodopteralituracellSpliApaf-1proteininapoptosisATheSisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementFortheM．SDegreeinBiologyByJingyanZhaoPostgraduateProgramCollegeofLifeSciencesCentralChinaNormalUniversitySupervisor：PengJianxinAcademicTitle：Prolessorsi驴栅举ApprovedMay,2014硕士学位论文MAST

3、ER’STHESIS华中师范大学学位论文原创性声明乖使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。作者签名：k娥反日期：知J中年西月j6日学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

4、和电子版，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密，在——年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。．作者签名：盛四踌(辟导师签名：槲日期：处岬年oN“日’日期．劲孵f-月堪日本人已经认真阅读“CALIS高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交“CALIS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的规定享受相关权益。回丞诠塞握童厦溢卮；旦坐生；旦二生；旦三生

5、筮查!作者签名：击&姥晦日期：乃l≯年移月二6日挪戳：糊日瓤砂I。够月铭日硕士学位论文MASTER’STHESlS摘要细胞凋亡通路的研究受到科学工作者的广泛关注，并且取得了众多成果。目前研究的较为透彻的是在线虫、果蝇和人类中的细胞凋亡通路，由于细胞凋亡事件在进化过程中的保守性，它们存在着许多相似的地方，但也有许多进化上的分歧引发的不同。最具保守性的是内源性线粒体凋亡通路，以哺乳动物为例，当细胞发生凋亡时，细胞色素C从线粒体的内外膜间质释放到细胞质中，跟位于细胞质中的Apaf-1结合引起其聚合形成凋亡体复合物，继而募集起始Caspase9酶原并活化形成一个大型的蛋白水

6、解机器，切割活化效应Caspase引起凋亡的级联反应。然而在对鳞翅目昆虫凋亡通路的研究中却发现了与进化上相近的果蝇凋亡通路中相左事件，即内源性通路起始因子细胞色素C在该通路中是否参与的问题。凋亡体复合物是内源性线粒体通路的中心，而其组装亚单位Apaf-1更是该通路的核心蛋白，对鳞翅目昆虫Apaf-1的研究将为进一步揭示昆虫细胞凋亡通路的分子机制提供条件。本研究首先制备了斜纹夜蛾细胞Apafq蛋白的多克隆抗体，并运用该抗体对gpaf-1蛋白的功能进行初步研究。根据本实验室获得的斜纹夜蛾Apaf-ISNP序列，选取其中一段编码147个氨基酸的保守序列作为目的片段，构建原

7、核表达载体pET22b—ApaflNl47，表达并纯化融合蛋白His．ApaflNl47，免疫兔子制备多克隆抗血清，然后以亲和层析的方法纯化所获得的抗血清并通过Westernblot检测。结果表明，制备并纯化后的抗体可以特异性结合原核表达的Apaf-1抗原蛋白和斜纹夜蛾内源的Apaf-1蛋白。斜纹夜蛾Apaf-1兔多克隆抗体的制备，为进一步研究鳞翅目昆虫Apafq蛋白的结构和功能提供了有力的条件；同时，我们也提出了一个快速高效纯化多克隆抗体的方案。通过免疫荧光，我们利用所制备的Apaf-1兔多克隆抗体以及带有FITC标签的荧光二抗，以BSA作为对照间接地鉴定了这