骨髓来源细胞在小鼠牙髓再血管化过程中的作用

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1、南方医科大学2011级博士学位论文骨髓来源细胞在小鼠牙髓再血管化过程中的作用TheRoleofBoneMarrow—derivedCellsinPulpRevascularizationinMouseModel课题来源：国家自然科学基金(81271135)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员徐稳安丁自海教授昊补领教授人体解剖与组织胚胎学学术型博士研究生基础医学院钟世镇院士汪华侨教授顾立强教授李国新教授靳安民教授2014年4月30日广州博士学位论文骨髓来源细胞在小鼠牙髓再血管化过程

2、中的作用博士研究生：徐稳安指导教师：丁白海教授吴补领教授摘要研究背景牙髓病、根尖周病是口腔科的常见病，多发病，其主要治疗方法是根管治疗，即在摘除感染坏死的牙髓组织、去除根管内感染物质的基础上，用根管充填材料封闭原来牙髓组织所占据的空间，阻止细菌的侵入，以达到消除炎症的目的。由于牙髓组织完全破坏，牙齿失去营养支持，丧失了原来的感觉及代谢功能，牙体变色，影响美观，牙体组织变脆易折，需要进行冠修复。同时，根管治疗的技术敏感性较高，需要精密的仪器和较高的技术，治疗过程较为复杂。根管治疗及后续的冠修复均为非生物修复，不能形成健康美

3、观的自然牙、生物牙。由于年轻恒牙自身解剖特点，牙根发育不完全，根尖孔尚未形成，根尖呈开放状态。当年轻恒牙出现牙髓严重病变或根尖周感染时，由于开放的根尖无法形成有效的封闭，不能进行常规的根管治疗。目前，对于年轻恒牙根尖周炎的常规治疗方法有手术后倒充填治疗和根尖诱导成形术后再进行根管治疗。根尖手术后倒充填治疗无法促进牙根的继续发育，常导致牙根变短，冠根比加大，患牙远期保存效果差。另一种治疗方法是进行根尖诱导成形术，使根尖部形成牙本质桥，封闭根尖孔。中文摘要近年来，有临床研究和一系列病例报道均表明，牙髓坏死的年轻恒牙经过根管消

4、毒、诱导血液进入根管和冠部的严密封闭，能够获得牙根的继续发育和新生组织长入根管，x线表现为牙根变长、根管壁增厚、根尖孔闭合和根尖病变消失，同时牙齿重新获得牙髓活力，这一治疗方法称为“牙髓再血管化”(PulpRevascularization)。然而，在取得良好临床疗效的同时，相应的动物实验却证实，根管内的新生组织与正常牙髓完全不同，是由类牙骨质、骨样组织，牙周膜样组织和疏松结缔组织组成的。如何使新生的“再血管化”组织更加接近正常牙髓的组织结构和功能，是目前“牙髓再血管化”研究中面临的最关键问题。要解决这一问题，就需要对牙

5、髓再血管化过程中干细胞成分的来源、不同来源干细胞之间竞争增殖的机制进行深入系统的研究。牙根继续发育、新生组织的细胞来源和牙髓再血管化的确切机理仍然不清楚。多数学者推测其细胞有多种来源，包括残存活髓组织的牙髓干细胞(DPSCs)、根尖牙乳头干细胞(SCAPs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)和骨髓干细胞(BMMSCs)。事实上，牙髓坏死和严重的根尖周感染(根尖病变的存在)，以及根管消毒和冲洗药物会显著损伤牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞，这两组干细胞参与牙髓再血管化的可能性很小。因此，我们提出假设：骨髓来源细胞可能参与牙髓再血管

6、化的过程，是新生组织的主要细胞来源。研究目的和内容本实验拟通过建立小鼠磨牙去髓后牙髓再血管化模型，明确小鼠牙髓再血管化的发生过程及组织学特点。进一步通过建立小鼠GFP+骨髓嵌合体模型，观察骨髓来源细胞参与维持颌骨和牙齿组织及全身其他组织稳定中的作用。并通过对GFP+骨髓嵌合体小鼠磨牙进行牙髓再血管化处理，探讨骨髓来源细胞在牙髓组织再血管化过程中的相关机制。为后续实验如何调节骨髓来源细胞在牙髓组织再血管化过程中的增殖和分化奠定基础。Ⅱ博士学位论文材料与方法(1)选取4周龄C57BL／6小鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，使用

7、自行设计的小鼠专用固定和口腔牵拉装置将小鼠固定置于口腔手术显微镜下，碘酒消毒手术野，并放置吸唾器，全部实验过程保持无菌操作。对实验牙进行牙髓再血管化处理，使用高速不锈钢球钻(#1／4)从牙合面进行开髓，然后用6#K锉去除牙髓，生理盐水冲洗，6j；f和8群K锉继续清理根管内残留的牙髓，并适当扩大根尖孔，生理盐水冲洗根管，无菌纸尖吸干，8#K锉插入根尖，刺激根尖周组织出血至根管口水平，置一生理盐水湿棉球，等待5分钟让血液形成血凝块，MTA覆盖，光固化流动树脂严密封闭开髓孔。分别于术后1周，4周，8周处死动物，进行影像学和组织

8、学观察牙髓再血管化情况。(2)通过将GFP+转基因小鼠骨髓细胞移植到经放射性照射处理的野生型C57BL／6小鼠体内，形成GFP+骨髓嵌合体小鼠，通过小动物活体成像和组织学方法观察骨髓来源细胞在牙髓、牙周组织、心脏、肺脏、脂肪、皮肤、肾脏等组织的分布。(3)在建立好的GFP+骨髓嵌合体小鼠模型的基础上，对嵌合体小鼠第一