LPS刺激的小鼠骨髓来源树突状细胞生长和细胞周期分析

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1、第二军医大学硕士学位论文LPS刺激的小鼠骨髓来源树突状细胞生长和细胞周期分析中文摘要树突状细胞(DC)是目前己知的功能最强的专职抗原提呈细胞。它们在体内广泛分布于血液、肝、脾、淋巴结以及其他非免疫组织器官中并有各自的名称：如淋巴器官中的并指状细胞，血液中的单核细胞和表皮中的郎罕氏细胞。DC具有多种才i同的形态、表型和功能。已知DC的功能特点与其不成熟(immature)和成熟(mature)状态密切相关：总体上讲，不成熟的树突状细胞具有高效的抗原摄取、处理功能，呈非活化状态。因为表达共刺激分子和MHC水平较低，不成熟树突状细胞对T细胞的激活作用

2、较弱。遇到感染信号后，不成熟树突状细胞摄取、处理外来抗原，经历一个分化成熟过程并且迅速表达大量共刺激分子和稳定的MHC而转变为成熟状态。此时树突状细胞的抗原提呈功能大大增强，而抗原摄取能力已大大降低，它们会迁移到淋巴器官刺激和活化初始T细胞增殖。树突状细胞系统包括许多功能不同的亚群。按照表型和功能可以把小鼠树突状细胞的分为六个主要亚群：CD8。DC、CD8+DC、CD8intDCs、朗罕氏细胞(Langerhanscells)、皮肤DCs(DermalDCs)和类浆细胞(B220*)DCs。每个亚群有不同的功能。例如，在体外Fas诱导T细胞凋亡

3、时，CD8"DCs会引起CD4+T细胞产生强烈的增殖反应，而CD8+DCs诱导的反应相对较弱。B220+DCs通过诱导调节性T细胞的分化来介导T细胞耐受。还有人报道不成熟DC也可以通过诱导调节性T细胞的分化间接引起T细胞失能和耐受：而同一批不成熟DC(imDC)，接受了刺激信号后即分化成熟，从而启动效应性T细胞的活化。由于树突状细胞在初次免疫应答中所扮演的重要角色，研究DC在肿瘤免疫和免疫耐受中的调节作用有重大意义。DC的不同成熟阶段和成熟过程是被精确而有效地调控着的。根据他们在微环境接受的精确信号，DC可以达到不同的活化状态以及不同的成熟状态

4、从而发挥不同的功能。DC的成熟可以由多种刺激物触发，包括接触性变态反应原，细菌和病毒，白细胞介素．1(interleukin．1，IL-1)、II．,-6、肿瘤坏死因子a(Th'F-a)等促炎症细胞因子，未甲基化CpG、poly(I：C)等免疫刺激物，信号分子CD40L等等。脂多糖(Lipopolysacchafide，LPs)是革兰氏阴性细菌胞壁组分，是Dc(包括3第二军医大学硕士学位论文B细胞和单核细胞)成熟的强有力促进物，可提高他们的抗原递呈能力并促进炎症细胞因子的产生。虽然人们已经对DC发育成熟、功能状态及其诱导和调控因素等进行了许多研

5、究，我们以前的实验，通过细胞表型、形态学特征和功能研究也证明：LPS短期刺激可诱导DC成熟，而长期刺激则使得DC处于不成熟状态；PKCB可能参与调控DC的成熟。但目前对DC生长的详细细胞生物学特征(特别是对其细胞周期)及其分子机制的研究不多。由于细胞生长的细胞生物学特征及其分子机制与该细胞的发育、成熟、分化和发挥功能密切相关，所以我们在研究了LPS和cpG对小鼠骨髓来源的DC发育成熟和功能研究后，拟进一步研究DC生长的细胞生物学特征及其分子机制。由于LPS对DC有多方面的影响，也是研究最成熟的、诱导DC发育成熟的因子，我们选用LPS作为刺激剂，

6、旨在了解成熟DC(LPS短期刺激)和不成熟DC(LPS长期刺激)的生长状态和细胞周期有何不同，并进一步了解这种不同的分子机制。研究细胞生长的细胞生物学特征的方法有很多，例如用不同试剂抑制细胞生长于某个特定细胞周期，使细胞聚集在该细胞周期，撤除抑制剂后，细胞从该周期同时进入细胞周期的下一阶段，此方法称为同步化。同步化可得到处于同一细胞周期状态的大量细胞，有利于富集足够的细胞进行细胞生物学研究。用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5，6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE)着染细胞，细胞

7、每分裂一代，其含量就降低一半，利用这个特性可研究细胞在一定时间内分裂的次数；用【3H】TUR或BUdR掺入细胞，在细胞生长一定时间后，根据细胞数判定细胞的传代次数等。目前有很多种鉴别基因表达差异的技术。这些技术为细胞生物学家研究细胞的生命过程提供了一个重要的工具，比如：核酸印迹杂交(Nonherablotting)、RTopCR、差异显示法(Differentialdisplay)和RNA酶保护试验(RNAseprotectionassavsl等。但是，DNA基因芯片技术却可以在一个样品中同时快速检测成百上千的基因表达差异。这些DNA微列阵研究

8、的优点是，可以根据生物功能的相关性来精心挑选基因，这样所有基因的变化就一目了然。基因芯片方法使同时分析多个基因表达的情况成为可能。许多细胞生物学的过程