非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变异质性的单细胞水平研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变异质性的单细胞水平研究IntratumorHeterogenei哆ofEGFRMutationsInVestigatedbySingle·cenAnalysisinNSCLCPatientswithEGFRMutationalTumor课题来源：国家自然科学基金学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员郭珑华周清教授肿瘤学专业型惹撇。碱符立梧教授Jo．2李杨秋教授徘∥黎明涛教授笏2眵，余细勇教授／

2、1斛乔贵宾教授’／王声滂教授．张弓教授，匕兰论文评阅人杨衿记教授赵健教授2014年3月20日广州硕士学位论文非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变异质性的单细胞水平研究硕士研究生：郭珑华指导老师：周清教授摘要背景全世界恶性肿瘤中肺癌的发生率和死亡率越来越高，目前己位居世界前列，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％、85％。近年来，随着分子靶向治疗的问世，非小细胞肺癌的治疗取得了突破性的进展。目前国内外均有大型随机对照临床试验证明了分子靶向药物表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制(TKIs)

3、一线治疗具有EGFR基因活化突变的NSCLC患者，疗效显著提高，患者的生存期明显延长。但是，随着分子靶向治疗的发展，耐药问题已成为分子靶向治疗的一个瓶颈。临床上发现，晚期NSCLC中同样具有EGFR基因活化突变的患者，在接受EGFR—TKIs治疗后疗效存在较大的差异，并且最终都会出现耐药而导致治疗失败。目前已明确的EGFR—TKIs耐药机制有EGFR基因20外显子T790M突变、cMET扩增。在EGFR突变型NSCLC并对EGFR—TKIs继发性耐药的标本中，约50％检出了EGFR基因20外显子T79

4、0M突变，约20％检出了cMET基因扩增。近年来研究提示，EGFR—TKIs耐药问题还可能和EGFR基因突变异质性有关，即同一瘤灶的不同部分，同一患者的不同瘤灶以及同一瘤灶治疗前后EGFR基因突变状态都有可能不一致。目前对于具有EGFR基因活化突变的NSCLC患者肿瘤中究竟是否存在EGFR基因突变异质性及这种异质性与EGFR—TKIs耐药的相关性，研究还存在争议。I摘要恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多步骤的演进过程，有研究表明EGFR基因突变在肺腺癌中是一种早期事件，在这种早期就已经发生EGFR基

5、因突变的肺腺癌组织中，随着细胞的克隆性生长，癌组织中EGFR突变应该具有较高的同质性。但是也有研究表明细胞在克隆性生长过程中可能受到复杂微环境的影响而发生各种不同的变化，从而造成分子水平中基因及组织水平中病理类型的异质性。实体瘤内正常细胞的混杂是造成EGFR基因突变异质性研究存在争议的一个重要原因。单细胞基因分析技术是一种更科学、更灵敏的生物学技术，可深入探索肿瘤内部的基因异质性。全自动激光捕获显微切割仪和流式细胞仪的发展使单细胞获取成为可能。单细胞聚合酶链反应(PCR)和单细胞测序技术广泛应用于微生

6、物领域的单细胞基因研究、植入前基因诊断(PGD)的单基因突变研究、异质性肿瘤的基因表达特点研究中。也有文献报道：建立在单细胞PCR基础上对单个细胞进行EGFR基因检测是可行的。因此，从单细胞水平可以对肿瘤内部的EGFR基因突变异质性进行更深入、全面的研究。目的本研究首先采用流式细胞仪分选肿瘤细胞株中的单个细胞，进行单细胞多聚酶链反应(PCR)扩增EGFR基因单个外显子及单细胞测序，探讨单细胞PCR扩增和测序技术的可行性，在此基础上，采用显微切割技术捕获EGFR活化突变阳性患者肿瘤组织切片中的单个肿瘤细

7、胞，进行单细胞PCR扩增和单细胞测序，从单细胞水平探讨晚期NSCLC患者肿瘤组织内是否存在EGFR基因突变异质性及其与EGFR—TKIs疗效的关系。第一部分单细胞PCR扩增和测序技术可行性的研究方法1．细胞株的选取选取H1975和PC一9两种肿瘤细胞株，这两种细胞株均是经单个细胞克隆培养起来的，前者同时具有EGFR基因20外显子T790M和21外显子L858R杂合突变的特点，后者则具有EGFR基因19外显子缺失的特点。TT硕士学位论文2．单细胞混悬液的制备在细胞培养瓶中分别培养H1975和PC一9这两

8、种细胞株，待细胞长势良好，长满培养瓶80’90％时，用胰酶消化细胞，制备这两种细胞株的单细胞混悬液。3．流式细胞仪分选单细胞紫外线消毒流式细胞仪操作台，打开流式细胞仪，设置分选参数，用流式细胞仪分选单个细胞到96孔PCR板中，每排设置一个空白对照孔，用细胞裂解液裂解细胞。4．单细胞PCR扩增用25ulPCR扩增体系，加入Promega酶和EGFR基因相应外显子引物，常规PCR扩增反应条件为：94℃5min；(94℃30sec一58℃45sec一72℃45