血凝酶--脂质体--微泡复合物的制备及其体外凝血的实验研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文血凝酶一脂质体一微泡复合物的制备及其体外凝血的实验研究Thestudyofthepreparationandcoagulationinvitroofthecomplexofhemocoagulase—liposomesandmicrobubbles课题来源：全军医学科研“十二五”计划课题项目(CWsl2J076)广东省科技计划项目(2011B080701019，20128031800309)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员李婷李叶阔副教授影像医学与核医学专业型硕士研

2、究生第一临床学院吴凤林教授欧陕兴教授赵萍教授查道刚副教授朱贤胜副教授2014年5月19日广州硕士学位论文血凝酶-．EJ旨质体一微泡复合物的制备及其体外凝血的实验研究研究生姓名：李婷指导教师：李叶阔副教授摘要研究背景：活动性出血是腹部实质脏器闭合性创伤急性致死的主要因素之一。目前常用的方法止血方法有外科手术、选择性动脉栓塞以及射频凝固等方法，但是它们具有的愈后差、操作复杂以及容易损伤创伤部位周围正常组织等缺陷。因此我们拟探索一种更为简便、有效以及无创的止血方式控制活动性出血。我们拟通过一种载体运载止血剂到达活动性出血部位，通过低机械指数超声发现活

3、动性出血部位，而后通过聚焦超声激发载体释放止血剂，从而达到止血目的。脂质体一微泡复合物集合了脂质体以及微泡的优势，既可以超声显影又可以运载药物被超声激发释药，然而将其用于止血的研究尚不多见。本研究拟采用此载体，将血凝酶包封于脂质体内并通过亲和素一生物素系统将其与微泡相连，制备载止血剂的脂质体一微泡复合物，为实现腹部实质脏器闭合性创伤活动性出血的一体化诊疗新方法奠定基础。第一章脂质体包封血凝酶的实验研究研究目的：研究脂质体包封血凝酶的可行性。材料和方法：l两种逆相蒸发法的选择摘要以DPPC(1，2-Dipalmitoyl—Sn—Glycero一3

4、一Phosphocholine，二棕榈酰磷脂酰胆碱)、CH(Cholesterol，胆固醇)、DSPE—PEG2000Biotin(1，2一Distearoyl—Sn—Glycero一3一Phosphoethan01amine～N一[Biotinyl(PolyethyleneGlyc01)一2000]，生物素酞化聚乙二醇2000修饰二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)为原料，通过两种逆相蒸发法包封血凝酶，检测所得脂质体的粒径，并对脂质体悬液的外观进行观察，初步评估脂质体浓度。4℃储存12h、24h、36h后观察脂质体悬液外观变化，从而确定本实验所用血凝酶的包

5、封方法。2脂质体包封血凝酶将血凝酶冻干粉末溶解于去离子水中，于4。C进行透析处理，透析4．5h。将DPPC、CH、DSPE—PEG2000Biotin粉末以摩尔比60：40：5完全溶解于三氯甲烷中，加入15％三氯甲烷体积的无水乙醚。加入有机溶剂1／3体积的血凝酶溶液。对混合液进行声振处理4min。将混合液真空条件下干燥处理1h。取干燥后混合液，14000g离心处理30min。取下层乳白色凝胶物以11mmol／l脂质浓度溶解于去离子水，充分混合均匀。3理化性质检测通过纳米粒度及电位分析仪检测血凝酶一脂质体的粒径以及表面电位；将血凝酶一脂质体悬液分

6、别于室温(25℃)及4℃静置12h、24h、36h、48h，观察脂质体悬液有无浑浊、沉淀及分层；梯度稀释血凝酶溶液，按照BCA(BicinchoninicAcid，二喹啉甲酸)蛋白浓度测定的方法，于562nm检测吸光度，绘制血凝酶的标准曲线。通过公式计算包封率：包封率(％)：坠：坠皇×100∥总形总代表脂质体悬液加入终浓度为l％的TritonX一100水溶液处理后至脂质体完全破裂溶液中的药物总量。鼢离代表未经过处理前悬液中未包封的药物含量。结果：第二种逆相蒸发法包封1单位／ml血凝酶的脂质体的浓度>第一种逆相蒸II硕士学位论文发法包封2单位／m

7、l血凝酶的脂质体的浓度>第一种逆相蒸发法包封1单位／ml血凝酶的脂质体的浓度。第一种逆相蒸发法包封2单位／ml血凝酶的脂质体的粒径>第-It逆相蒸发法包封l单位／ml血凝酶的脂质体的粒径>第二种逆相蒸发法包封1单位／ml血凝酶的脂质体的粒径。本研究选择第二种逆相蒸发法制备血凝酶一脂质体，通过此方法获得的血凝酶一脂质体悬液呈均一半透明状态，平均粒径约(431．95±19．04)nm，表面电位为(一22．13±0．35)mv，并于室温(25℃)及4℃静置48h内无浑浊、沉淀及分层。结论：血凝酶可以通过逆相蒸发法被脂质体包封，粒径为纳米级，表面带负电

8、，具有良好的稳定性，包封率为35．08％，为与微泡相连奠定了基础。关键词：脂质体血凝酶逆相蒸发法Ill摘要第二章亲和素一生物素法连接血凝酶一脂质体与微