人肾近曲小管上皮细胞凋亡及调控论文

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1、人肾近曲小管上皮细胞凋亡及调控论文人肾近曲小管上皮细胞凋亡及调控论文预读：摘要：摘要目的研究高糠诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制.方法以人肾近曲小管上皮细胞株HK2为研究对象，随机分为対照组、高糖组、甘露醇组.MTT、流式细胞术观察细胞的增殖和凋亡状况；ELISA法检测细胞内Caspase的活性；Westernb1ot法分析B淋巴细胞瘤2（Bc12）及Caspase家族蛋白的表达变化.结果与对照组比较,高糖组能抑制HK2细胞的体外增殖，下调抑制凋亡作用的蛋白Bc12表达，上调促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表达（PVO05）；流式细胞术显示HK2细胞周期有明显的变化，且随葡•萄糖浓度

2、的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明显上升（PV001），并且Caspase酶原降解及活性表达也呈上升趋势（P<001）.结论高糖能抑制IIK2细胞体外增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过Bc12及Caspase家族调控HK2细胞的凋亡.关键词高糖；HK2；凋亡；表达细胞凋亡是生理性过程，不同于细胞坏死；凋亡细胞能产生吞噬和清除碎片的凋亡小体，避免周围环境中细胞损害，维持内环境稳定［1］•糖尿病肾病（diabcticnephropathy,DN）发病机制复杂,DN早期，肾脏通过细胞凋亡等应急反应来清除过度增殖的内皮细胞，维持内环境稳定；DN晚期，随着肾功能障碍，内环境稳态破坏,细胞凋亡过度，

3、致使肾损害也加剧】2-3］.了解和干预肾小管内皮细胞凋亡有助于延缓DN进展.该研究采用体外培养人肾近曲小管上皮细胞株IIK2细胞,分析高糖坏境下IIK2细胞的增殖和凋亡状况、B淋巴细胞瘤2（Bcc111ymphoma2,Bc12）及Caspase家族蛋白表达的变化，并进一步探讨这些作用可能的分子调控机制.1材料与方法1.1材料低糖（55mmol/L）DMEM（美国Gibico公司）；Dg1ucose、医用甘露醇（北京国药集团公司）；Gibeo原装小牛血清（北京索莱宝科技有限公司）；HK2由中国科学技术大学生命科学院赠送，液氮保存；AnncxinVFITC（安徽碧云天生物试剂公司）；一抗ac

4、tinCaspase3、Caspase9、Bc12Bax、Bak>Caspase7（美国SantaCruz公司）；MTT（美国Sigma公司）；二抗（美国Pierce公司）.1.2方法1.2.1细胞培养和分组液氮取出HK2细胞,37C水浴解冻,迅速接种于含10%小牛血清低糠DMEM（葡萄糖浓度55mmol/L）,37C、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中.胰酶消化传代，备用•分组:对照组（葡萄糖浓度为55mmo1/L）、高糖组（衙萄糖浓度分别为25.4Ommo1/L）和甘露醇组（葡萄糖浓度55mmo1/L+甘露醇浓度分别为195、345mmo1/L）.1.2.2MTT法检测细胞增殖取生长旺盛

5、的HK2细胞，胰酶消化，按121分组,MTT实验严格按照前期报道［4］操作，实验重复3次.1.2.3AnnexinVFITC分析细胞凋亡取对数期生长的HK2细胞，胰酶消化传代,制成细胞悬液，取合适的量平均接种于6孔板,次日按121分组,37°C刺激48h,各组胰酶消化制成约1x106个/m1细胞悬液.400plAnnexinV结合液重悬,加入5P1AnncxinVFITC染色液,2〜8C避光孵育15min.4C冷冻离心5min（10000r/min）,去除上清液，再用400plAnnexinV结合液重悬,1Opl/孔PI染色液，震动器轻轻混匀；锡箔纸包裹置冰上孵育5min,然后上机检测.1

6、.2.4Caspasc蛋白酶原活性检测原理:依据ELISA抗原抗体结合的原理,细胞内活性的Caspase7>Caspase3>Caspase9能在体外与相应的酶结合，催化底物显色反应，通过吸光度(optica1density,0D)值OD405來间接反应Caspase7>Caspase3、Caspase9的活性.取对数期生长的UK2细胞，按123步骤操作,分组后置于培养箱连续刺激2d,胰酶消化，冷冻离心5min(10000r/min)，按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶标仪检测，实验重复3次.1.2.5Westernblot法检测提取总蛋白:按121分组批量培养，刺激48h后,弃去

7、原液并用PBS洗去残留液体，置冰上,每瓶加裂解液150卩1充分裂解，细胞刮子收集细胞,低温冷冻离心5min(10000r/min)，上清液置于一80°C备用,BCA测定蛋白浓度，每组加入浓缩蛋白上样缓冲液，水浴煮沸，分装备用,置于一20°C保存.配制125%SDSPAGE，微量加样针上样，先用40〜50V电泳浓缩胶,100V电泳分离胶，10OmA冰浴转膜,伊利脱脂牛奶封闭,PBS洗膜，置于一抗为Bc12(1：400),C