野生一粒小麦bac文库的构建和着丝粒区重复序列的克隆

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1、山东大学博士学位论文野生一粒小麦BAC文库的构建和着丝粒区重复序列的克隆姓名：陈凡国申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：夏光敏;张学勇2002.5.20。．．．．。————』銮蛰盥塞箜邈奎————————一摘要。基因组学的研究已经进入了后基因组学时代，即功能基因组学时代·在我国尽管水稻(OryzasativaL．ssp．indica)基因组全序列测序刚刚完成(Yueta1．2002)，但总体上仍然处于由结构基因组学向功能基因组学过度阶段，在一段时间内我国基因组学的研究仍将停留在基础研究上，如BAG文库的构建及基于BAC的物理作图等方面的研究

2、。小麦是世界和我国最重要的粮食作物之一，由于其庞大的基因组，致使某基盟组学的研究滞后于模式植物拟南芥(Arabidopsis仂a『『仃a)及水稻的研究一本研究利用普通小麦的二倍体祖先野生一粒小麦为材料，构建BAC文库，目的是为开展小麦基因组学的研究奠定一定的技术平台。(构建大片段DNA文库的关键技术包括载体和大片段DNA的制备两个方面。大量转化后，得到了约20万个克隆，15360个克隆以单菌落的方式存于40块38参孔板中，组成单克隆文库，其余以混合池的方式存放于6块384孔板中。j本文库插入片段平均为104kb，以野生一粒小麦基因组5600Mb计算

3、，该文库共覆盖了3倍以上的基因组，筛选到任一基因的可能性大于90％，另外分别用叶绿体基因psbA及线粒体基因atp6为探针，通过菌落杂交检测到细胞器DNA的污染率低于1％。f用水稻着丝粒重复序列RCSl为探针，与3072个克隆进行菌落杂交，得至心了32个阳性克隆，用RCSl与拟斯卑尔脱山羊草着丝粒重复序列Tcs250为探针进一步筛选，在32个RCSl相关的阳性克隆中任选10个克隆进行点杂交，分别有6个和5个阳性克隆。为了克隆RCSl相关片段，依据RCSl的序列设计了三对引物，将引物3从上述阳性克隆中扩增的一个600bp的片段克隆测序，发现与RCSl

4、部分片段达到约83％的同源，与大麦的反转座子(Ty3／gypsy)部分序列同源性达到了92％，与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了96％，命名为TBRCSl。TBRCSl可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成通过实验，作者还得到如1、过柱纯化技术是一种操作简单、省时、省钱的方法：影。：，—————。—』塑圣耋墼笪丝丝圣——；—，—。一2．自连回收可有效的提高载体的质量：3、载体与连接液的反复冻融使转化效率大大降低，而载体和连接液的分装可以避免或减少反复冻融；4、部分酶切前、后的预电泳可以有效的去除小片段DNA的干扰，提高大片段DNA的分离质量

5、和文库的质量；5、100-200kb的大片段DNA的转化效率最高，平均插入片段最大，而大于300kb的片段转化率极低；6、二次电泳技术使大片段DNA质量明显提高且片段整齐度好，而小片段DNA含量明显降低}，尽管片段浓度适合建库要求，但DNA损失严重；一次电泳技术可以得到足够量的大片段DNA，但是如果掌握不好会混杂有大量的小片段DNA，影响文库的质量；卜r7、载体与大片段DNA的摩尔比为3—5：1时连接和转化效率较高；8、浓缩连接液可以有效的增加转化效率；f转化的总菌数可达2500．5000个／uL连接液：h／9、实验证明混合池经过12个小时的培养后

6、结构仍然稳定。本研究所建野生一粒小麦BAC文库是我国迄今构建的第一个小麦属BAC文库，以该BAC文库为平台可开展基因的图位克隆、物理图谱的构建、着丝粒及端粒的研究等方面的研究工作。关键词：野生一粒小麦基因组细菌人工染色体文库着丝粒序列2Thegenomicsresearchhascomeintopost-genomiceera．inanotherword．functionalgenomicsera．However-itisStillinchangingfromstructuralgenomicseratofunctionalgenomicserai

7、nourcountry．Wewillfocusonconstructionoftheplatformsforslongtime．suchasconstructionofBAClibrary,physicalmappingbasedonBACandsoon．thoughthewholegenomeofrice(OryzasaUvaL．Ssp．Indice)hasbeensequencedinChina(Yuetal，2002)．Commonwheat(TriticumaesUvumL．2n=42，AABBDD)isoneofthemostimport

8、antcropsintheworld．Becauseoftheverylargesizeandcomplexityofge