tnf原核表达系统建立的初步研究论文

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1、ClassifiedIndex:Q36U.D.C.:570DissertationfortheMasterDegreeinScienceTHEPRELIMINARYSTUDYONTHEESTABLISHMENTOFTHETNFPROKARYOTOESEXPRESSIONSYSTEMCandidate:ZhangYuSupervisor:AssociateProf.XuZhongAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:GeneticsAffiliation:LifeScienceandEngineeringDateofDefence:

2、June,2009Degree-Conferring-Institution:HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor,简称TNF）是一种新型的细胞因子，系由激活的巨噬/单核细胞系统所产生的一种内源性调节因子，对多种肿瘤细胞具有直接杀伤作用，是一种理想的抗癌药物。虽然大肠杆菌作为外源基因高效表达的首选体系，遗传背景清楚,技术操作简单，但是大肠杆菌产生内毒素、表达产物生成包涵体等缺点使得大肠杆菌作为TNF宿主的前景并不乐观。蓝藻是一种结构简单的光合原核生物，且多数不含内毒素，不形成包涵体，不需作

3、变性、复性处理，近年来蓝藻基因工程已经形成了一套稳定的基因转化体系，可以有效地转化外源基因，并稳定表达；因此，蓝藻作为新的基因工程宿主细胞备受关注。但是外源基因在蓝藻中的表达率只有千分之几，亟需提高外源基因在蓝藻中的表达率。本研究通过双酶切从pMD-489-TNF质粒中获得TNF基因，将TNF基因插入到表达载体pET-24(+)的多克隆位点中，获得重组质粒pET-24-TNF并转化E.coli.BL21(DE3)pLysS，获得重组蛋白表达菌株；并设计正交试验优化TNF在工程菌中的表达，利用ELISA和SDS-PAGE进行检测，发现在25℃下，BL21-pET-TNF菌在OD600=0.8时

4、经0.4mmol/L的IPTG诱导6小时，TNF蛋白在BL21-PET-TNF中的表达率最高，为22.76%；但是分析在37℃和42℃时TNF蛋白在菌体内累积形成包涵体，因而使表达率下降，如果排除形成包涵体的因素，TNF的表达率会进一步提高，这为下一步将pET系统应用到蓝藻奠定了基础。对聚球藻和转基因聚球藻的培养条件进行了研究，两种藻分别在不同温度下、不同光强和不同氮源及不同碳源浓度条件下进行培养，结果表明，在相同培养条件下，野生聚球藻的生长量较转基因聚球藻高，但二者差别不大；28℃，2000lx，1.0mg/l的NaNO3是最佳培养条件，添加适当的碳源有利于野生聚球藻和转基金聚球藻的生长，

5、培养条件的摸索，将会对下一步TNF转入蓝藻后的培养奠定基础。关键词：人肿瘤坏死因子；野生聚球藻；转化聚球藻-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractTumorNecrosisFactor-α(TNF-α)whichisoneofendogenousregulatoryfa-ctorsproducedbyactivedmonocytes/macrophagesisanewkindofcytokine.Ithasdirectcytotoxiceffectsonavarietyoftumorcellsandisanidealanti-cancerdrugs.Althoughasthefi

6、rstchoiceofhigh-levelexpressionofheterologousgene,Escherichiacoli(E.coli)hasthewell-knowngeneticbackgroundandalong-developedtransgenictechnology,theshortcomingssuchasendotoxinandtheformationofinclusionshavemadeE.coliwasnottheoptimistichostforTNF-α.Cyanobacteriahavesimplestructureandthemajorityofthe

7、photosyntheticproka-ryoteisendotoxin-free,non-formationofinclusions,notfordenaturationandrenaturation.Furthermoregeneticengineeringofcyanobacteriahasdevelopedastabletransformationsystemandheterologousgeneca