补肾生髓成肝关键蛋白质相互作用的机制研究

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1、湖北中医药大学博士学位论文“补肾生髓成肝”关键蛋白质相互作用的机制研究姓名：高翔申请学位级别：博士专业：中医内科学指导教师：李瀚旻20120520摘要目的：研究“补肾生髓成肝"治则治法的生物学基础，分析补肾(左归丸)调控骨髓间质于细胞(MSCs)转化为肝细胞这一过程中所涉及的关键蛋白质靶点，为骨髓干细胞转化为肝细胞的临床运用和补肾治疗肝病提供科学的实验依据，进一步揭示“肾生骨髓，髓生肝”和“肝肾同源"的科学内涵，丰富“髓失生肝"新的病因病机和“补肾生髓成肝”新的治则治法，使中医理论认识有所突破、有所发展。方法：本研究在“补肾生髓成肝"治则治法理论

2、所具有的l临床和实验研究基础上，运用蛋白质组学的研究思路和研究方法技术整体分析补肾(左归丸)调控骨髓间质干细胞(MSCs)转化为肝细胞这一过程中蛋白质组的差异表达、确定关键蛋白质，并运用免疫共沉淀技术结合生物信息学分析研究其关键蛋白质的相互作用。2m龄Wistar大鼠(SPF级)40只，随机分为左归丸药物血清组和空白血清组用于制备左归丸药物血清，按10ml／kg／d剂量给予左归丸灌胃，空白组给予同等体积的生理盐水灌胃，连续给药15d后颈动脉插管取血，2500rpm离心20min，取同组上层血清混合，O．22gm微孔滤膜过滤除菌，4。C保存备用。利

3、用2d龄Wistar乳鼠获取肝组织，肝组织贴壁培养法获得原代肝细胞，传代后种植于六孔板中作为共培养体系的诱导源细胞。引进赛业(广州)生物科技有限公司OriCellvMWistar大鼠骨髓间质干细胞，复苏培养后传代于插入式培养皿，待细胞贴壁后将培养皿置于种有肝细胞的六孔板内，建立骨髓间质干细胞．肝细胞共培养体系。共培养体系按组别分别加入10％左归丸药物血清和10％空白血清，每10天更换共培养体系中的肝细胞1次以保证肝细胞增殖活力。插入式培养皿内预先放置10％多聚赖氨酸包被的小玻片，定期收集细胞爬片用于指标检测。PAS法检测共培养7、15、30d时插

4、入式培养皿内细胞爬片糖原表达，ICC法检测共培养7、15、30d时插入式培养皿内细胞爬片肝系细胞特异性标志物AFP、CKl8、ALB表达，以原代培养的肝细胞爬片作为阳性对照，传代3次的骨髓间质干细胞爬片作为阴性对照，镜下观察(200x)，随机选取lO个视野计数I阳性细胞，将阳性对照片的阳性细胞率作为100％，比较两组不同时间点的阳性细胞率(％)。实验数据使用SPSS11．5统计软件进行统计分析，‘阳性细胞率以文zt：s表示，两样本均数的比较采用t检验。在共培养15d和30d时收集插入式培养皿内的细胞用于蛋白质组学研究，配制RIPA裂解液提取诱导培

5、养肝细胞的总蛋白样本，利用SDS．PAGE结合凝胶图像分析，确定差异表达的蛋白质条带，用干净的手术刀切取差异条带进行蛋白质质谱分析。根据测定所得的肽段信息使用MASCOT软件搜索Swiss．Prot数据库，比对与测定肽段对应的蛋白质，软件自动分析评定分数、45分以上为有效信息。检索NCBI公共数据库、InterPro数据库和UniProtKB数据库检索相关蛋白质的详细信息，获得蛋白质家簇、区域、功能位点等描述以进行生物信息学分析，确定“补肾生髓成肝丹关键蛋白质。提取正常Wistar大鼠肝组织总蛋白样本(非变性型)，利用免疫共沉淀技术检测“补肾生髓

6、成肝”关键蛋白质14．3．3蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、组蛋白H4的相互作用蛋白，利用SDS．PAGE结合凝胶图像分析确定蛋白表达条带，用干净的手术刀切取条带进行蛋白质质谱分析，质谱分析结果进行生物信息学分析。运用DAVID工具分析，蛋白质组中差异表达的蛋白给予功能注释，并给予聚类分析和信号通路分析。给予蛋白的各种不同方式聚类分析，从PIR源数据库给出的聚类图。结果：骨髓间质干细胞诱导培养3d后，10％含药血清组有少部分骨髓干细胞开始表现出肝细胞样细胞形态、细胞呈多边形、胞浆丰富、核大或多核，15d时约50％的细胞表现为肝细胞样细胞形

7、态，30d时80％细胞呈肝细胞样细胞形态。诱导培养30d时骨髓间质干细胞诱导的肝细胞糖原染色阳性细胞率(81．39±3．12)大于诱导培养15d的肝细胞(19．88±2．07)，差异具有显著性、P<0．05。诱导培养30d的肝细胞AFP阳性细胞率(3．74±o．47)显著低于诱导培养15d的肝细胞(19．36±2．66)、P<0．05。诱导培养30d的肝细胞CKl8阳性细胞率(91．14±7．03)显著高于诱导培养15d的肝细胞(59．21±3．61)、P<0．05。诱导培养30d的肝细胞ALB阳性细胞率(88．72±4．35)显著高于诱导培养1

8、5d的肝细胞(60．27±5．13)、P<0．05。利用GIS300凝胶成像分析系统获取凝胶图像，进行图像分析，选定差异条带，选取30d