c-ski、smad3和p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义

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1、河北医科大学硕士学位论文c--Ski、Smad3和p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义姓名：吴江乾申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：吴文新；张祥宏201203中文摘要c—Ski、Smad3和p15在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义摘要目的：大肠腺瘤是一种具有癌变潜能的良性病变，80％以上大肠癌由大肠腺瘤癌变发展而来，管状腺瘤是大肠腺瘤最常见的病理组织学类型，其癌变是由多因素、多基因综合作用的结果，癌变机制尚不明确。目前，TGF．p／SMAD信号通路在肿瘤发生发展中作用的研究成为医学界关注热点，TGF．p／SMAD信号通路参与

2、细胞增殖、分化等生理过程，生物信号经TGF．13／SMAD族配体与细胞膜表面的受体结合，由Smads蛋白传递给目的基因，通路中某些因子异常，可促进肿瘤发生发展。c．Ski基因属原癌基因，主要通过与TGF—p／SMAD信号通路下游转录因子Smad3结合形成复合物，阻止Smads蛋白磷酸化，抑制TGF．13／SMAD信号通路。研究发现c．Ski与人类多种肿瘤发生发展密切相关，有许多肿瘤细胞系如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺、胰腺癌等，具有转录活性和参与核转位的功能。Smads复合物可与目的基因结合调节下游相关因子转录，例如c．myc等。研究发现，在某些肿瘤中出现Smad3

3、高表达，如绒癌和胶质母细胞瘤；在某些肿瘤中如肝癌、胃癌、和皮肤鳞癌中Smad3表达量下降，而在结肠癌细胞系SNU．769A和SNU．769B中出现Smad3基因突变。p15是一种抑癌基因，是TGF．p／SMAD信号通路下游的靶点，参与TGF．p／SMAD信号通路对细胞生长及增殖程序的调节，是细胞周期抑制因子。研究发现许多肿瘤出现p15基因发生缺失和突变，表达量降低，如膀胱移行细胞癌、食管癌、肝癌和胃癌等。目前有关TGF—p／SMAD信号通路相关因子c．Ski、Smad3和pl5在散发性大肠腺瘤癌变中的意义研究国内外少见报道。本实验采用病理形态学观察结合免疫组织化

4、学、Westernblot、Realtime-PCR以及细胞培养方法检测正常大肠粘膜、伴有不同程度异型增生的散发性大肠管状腺瘤和大肠腺瘤癌变组织中c．Ski、Smad3和p15蛋白及mRNA的表达情况及与临床病理特征关系，并进一步分析三者相关性，探讨三者在散发中文摘要性大肠肠管状腺瘤癌变过程中的意义，为大肠腺瘤癌变预防和临床治疗提供理论依据。方法：1免疫组织化学方法采用免疫组织化学ElivisionTMplus两步法，研究20例正常大肠粘膜、8l例散发性大肠管状腺瘤伴上皮异型增生病例、32例大肠管状腺瘤癌变病例中c．Ski、Smad3和p15蛋白表达情况。2蛋白

5、免疫印记(Westernblot)用Westernblot方法检测18对新鲜大肠腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜以及HIEC和HT．29中c．Ski、Smad3及p15的表达情况。匀浆方法提取组织总蛋白；预冷的细胞裂解液加入细胞中，提取细胞总蛋白；经12％SDS．PAGED电泳，电转移到PVDF膜上，10％脱脂牛奶封闭1．5小时。一抗(c．Sl(i1：800；Smad31：5000；p151：500；)4℃过夜，二抗(1：8000)于37。C孵育1．5h，ECL显色。Odyssey仪器进行显色分析，Bio．LD图像分析系统进行定量分析。3Realtime．PCR应

6、用Realtime．PCR检测了18对新鲜大肠腺瘤癌变组织和相应正常大肠粘膜组织以及HIEC和HT．29中c．Ski和Smad3mRNA的表达情况，采用AppliedBiosystems公司提供的ComparativeCt(AACt)方法计算，计算目的基因的相对表达量。4细胞培养体外培养人类正常结肠粘膜上皮细胞株(HIEC)，用含10％的胎牛血清配以105U／L青霉素、100mg／L链霉素和0．625％胰岛素的RPMI1640．培养基培养；人类结肠癌细胞株(HT．29)，用含10％的胎牛血清配以105U／L青霉素、100mg／L链霉素的RPMI1640培养基培养

7、。细胞呈贴壁生长，取对数生长期的培养细胞，用0．25％胰蛋白酶+0．02％EDTA消化，进行细胞传代以及细胞的收集，进行相关研究。5统计学分析应用SPSSStatisticsl7．0软件，计量资料以均数-4-标准差(叉±S)表示，数据分析采用t检验、#检验、wilcoxon符号秩和检验及spearman相关分析，P<0．05时认为差异有统计学意义。2中文摘要结果：1c．Ski在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况1．1c．S虹蛋白的表达情况1．1．1免疫组织化学结果c．Ski在正常大肠粘膜、管状腺瘤伴不同程度异型增生组及管状腺瘤癌变组中的阳性表达率逐渐升高，分

8、别是10．00％(2／2