激光捕获显微切割结合定量蛋白质组学技术筛选人肺鳞癌早期诊断标志物

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1、中南大学博士学位论文激光捕获显微切割结合定量蛋白质组学技术筛选人肺鳞癌早期诊断标志物姓名：曾谷清申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：肖志强20120528博士学位论文中文摘要摘要肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。尽管肺癌的诊断和治疗水平已大大提高，但病人的生存率仍然很低，五年生存率低于15％。肺癌患者预后差的主要原因，一方面是由于肺癌发病机理仍然不是很清楚，另方面是缺乏有效的肺癌早期诊断标志物。因此，筛选肺癌早期诊断标志物对于提高疗效、改善预后具有重要意义。肺鳞癌起源于支气管上皮，是一

2、个多基因参与、多阶段的复杂病理学过程。在致癌因素作用下，支气管上皮细胞的癌变过程一般要经过基底细胞增生、鳞状化生，进而进展为不典型增生、原位癌，再发展为浸润癌。为了筛选新的肺鳞癌早期诊断标志物，揭示肺鳞癌癌变的机制，我们首先采用激光捕获显微切割(1asercapturemicrodissection，LCM)技术纯化正常支气管上皮组织、鳞状化生、不典型增生、原位癌、浸润癌组织，然后再用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合二维液相色谱串联质谱(2DLC．MS／MS)鉴定支气管上皮癌变过程中各阶段的差

3、异表达蛋白质。本研究共鉴定了102个差异表达蛋白质，在这些差异蛋白质中，有的在支气管上皮癌变过程中进行性上调，有的在支气管上皮癌变过程中进行性下调，有的呈阶段特异性改变。分层聚类分析显示：102个差异表达蛋白质聚集成8个簇，3大群。GO功能注释显示：第1群差异蛋白质主要涉及发育、凋亡、翻译和代谢等生物学过程；第2群差异蛋白质主要涉本课题受如下基金资助：国家自然科学基金(30973290，81172559，81172302)，芙蓉学者特聘教授计划(湘教通[20071362号)，湖南省科技重点科研项目(2010

4、FJ2009)，湖南省自然科学基金(11JJ2045)博士学位论文中文摘要及器官发育、凋亡、对生物刺激的应答和肌动蛋白丝束的形成等生物学过程；第3群差异蛋白质主要涉及代谢、细胞凋亡、运输、细胞大分子定位、细胞增殖和体液免疫应答等生物学过程。KEGG通路分析显示：这三群差异蛋白质涉及与肿瘤相关的一些信号通路，如MAPK信号通路，凋亡、细胞周期、p53信号通路、以及ErbB信号通路等。同一群差异蛋白为共同调节蛋白，它们在支气管上皮癌变的过程中可能具有相似的生物学功能，并可能通过这些信号通路发挥作用，从而促使支气

5、管上皮癌变。在102个差异蛋白质中，HSPBl的表达在支气管上皮癌变过程中呈进行性上调，GSTPl和CKB的表达在支气管上皮癌变过程中呈进行性下调。因此，我们选择HSPBl、GSTPl和CKB进行深入研究，采用Westernblotting检测这三个蛋白质在支气管上皮癌变过程中各阶段组织中的表达，结果与蛋白质组学结果一致；采用免疫组织化学染色检测这三个蛋白质在石蜡包埋的正常支气管上皮、鳞状化生、不典型增生、原位癌、浸润癌组织标本中的表达，并且采用ROC曲线分析评估它们早期诊断肺鳞癌的能力，结果显示：三个蛋白

6、组合判别正常支气管上皮和癌前病变的敏感性和特异性分别为96％矛N92％、判别正常支气管上皮和肺鳞癌的敏感性和特异性分别为99％#1198％、判别癌前病变和肺鳞癌的敏感性和特异性分别为92％和91％，结果表明：HSPBl、GSTPl和CKB联合检测能区分正常支气管上皮、癌前病变和肺鳞癌。为探讨GSTPl在肺鳞癌发病中的作用，我们以永生化的人支气管上皮细胞株16HBE为研究对象，采用siRNA干扰技术建立了稳定沉默GSTPl表达的16HBE细胞系(16HBE／PLO．1-GSTPl一shRNA)及空白载体转染的

7、对照细胞系；采用MTT细胞增殖测定、平板集落形成II博士学位论文中文摘要实验、软琼脂集落实验、流式细胞术和Hoechest33258染色等观察GSTPl表达沉默对苯并芘(B[a]P)转化16HBE细胞的影响。结果显示：与对照细胞比较，在B[a]P的诱导下，GSTPl表达沉默的16HBE细胞的增殖速度明显增快、平板集落数和软琼脂集落数均显著增加、细胞凋亡率显著减少。结果表明：GSTPl表达沉默显著增加16HBE细胞对B[a]P诱导细胞转化的敏感性。提示GSTPl表达下调参与了支气管上皮的癌变，GSTPl表达下

8、调有望成为预测吸烟人群对肺鳞癌易感性的指标。本研究采用LCM结合定量蛋白质组学技术开展支气管上皮癌变各阶段组织的比较蛋白质组学研究，鉴定了102个支气管上皮癌变相关的蛋白质，深入挖掘了102个差异表达蛋白质的生物学功能以及涉及的信号通路；发现HSPB1、GSTPl和CKB联合检测对正常支气管上皮、肺鳞癌癌前病变和肺鳞癌组织具有良好的判别能力，HSPBl、GSTPl和CKB可作为肺鳞癌早期诊断的潜在标志物；首次发现