利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学技术鉴定系统性淀粉样变性亚型

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1、学校代码：10023学号：200501063利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学技术鉴定系统性淀粉样变性亚型专业年级：北京协和医学院临床医学专业2005级姓名：孙维绎导师：周道斌(教授)李剑(副教授)北京协和医学院临床学院(北京协和医院)血液内科完成日期：2013年6月目录中英文缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯S引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第一部分微量福尔马林固定石蜡包埋(FFP

2、E)标本的蛋白提取方法的优化⋯10引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10实验材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．10实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17第二部分系统性淀粉样变性的激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMDIMS)分型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18々I旨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯J．D实验材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一18实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一46致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．-58中英文缩略词表2背景和目的摘要系统性淀粉样变性是一组由于含有反向平行13折叠片结构的蛋自在细胞外组织中沉积，进而造成心脏、肝脏、肾脏、骨髓、外周神经等器官功能不全的异质性疾病。目前普遍采用依据致病蛋白种类对淀粉样变性进行分型的原则，各类亚型的预后及治疗方案都不尽相同。但是，临床广泛应用的分型方法如免疫荧光和免疫组化法存在商品化抗体数量有限或抗体结合表位丧失等问题，检测的敏感性和特异性

5、均较低。国外已有少数研究显示，质谱蛋白质组学方法可成功应用于淀粉样变性的分型。激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD／MS)技术不仅能够实现快速准确的分型，同时可全面反映病变部位的蛋白构成，有利于深入发病机制研究。本研究的主要目包括：(1)建立利用LMD／MS技术鉴定系统性淀粉样变性亚型的方法；(2)利用LMD／MS方法对我院近13年的系统性淀粉样变性病例进行亚型诊断。实验标本来自于2000年1月至2013年3月北京协和医院病理确诊的系统性淀粉样变性病例。通过北京协和医院伦理委员会审查后，收集患者病变部位的福尔马林固定石蜡包埋病理标本。对己采集的标本进行切片、脱蜡、染色处理，利用激光显

6、微切割系统获取刚果红染色阳性的淀粉样变性病变区域，之后完成蛋白提取、酶切、多肽萃取、质谱检测、数据库搜索和数据分析，明确病变区域的具体蛋白构成，进而确定淀粉样变性亚型。结果本研究的72例淀粉样变性病例中有65例通过LMD，MS方法获得了明确的诊断结果，分型成功率为90．3％。7例病例因显微切割失败导致分型失败。1例病例经LMD／MS检测排除了淀粉样变性诊断。阳性对照组中的16例病例的LMD，MS分型结果亚型符合率为100％。64例成功分型的病例包括AL一1(型24例(37．5％)，AL一九型33例(51．6％)，ATTR型4例(6．2％)，AA型2例(3．1％)和AH型1例(1．6％)

7、。本研究中有8例患者接受过免疫组化法分型，其中只有3例有明确诊断结果，与LMD，MS分型结果相比较，仅1例的亚型诊断正确。因此，免疫组化法的分型准确性仅为12．5％。31例存在单克隆免疫球蛋白血症的病例经LMD，MS3检测均属于AL型淀粉样变性，未发现其他亚型合并单克隆免疫球蛋白血症。有2例病例的血清免疫固定电泳结果为阴性，但血清游离轻链检测提示存在单克隆轻链，且轻链类型与LMD／MS分型结果相符。结论利用LMD／MS技术鉴定系统性淀粉样变性亚