肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白质组学分析

《肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白质组学分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白质组学分析：施孟如，林全，郑易，王良兴【摘要】目的：建立肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液的双向电泳图谱，分析二者蛋白质表达的差异和特点。方法：选取肺腺癌伴胸腔积液标本12例，肺鳞癌伴胸腔积液标本8例，以固相pH梯度等电聚焦为第一向，垂直板SDS-PAGE为第二向分离胸水蛋白质，银染显色，扫描仪获取凝胶图像并对其进行分析。结果：同组实验重复3次，其中肺腺癌胸腔积液蛋白质点平均(376±17)个，同组匹配率为88.3%;肺鳞癌胸腔积液蛋白质点平均(383±21)个，同组匹配率为8

2、6%。经软件分析，肺腺癌胸腔积液中表达增高2倍的差异蛋白点29个，降低50%的蛋白质点50个。有3个点仅在肺腺癌胸腔积液表达，5个点仅在肺鳞癌胸腔积液中表达。结论：肺腺癌与肺鳞癌胸腔积液差异蛋白可能是不同病理类型的肺癌细胞分泌的特殊蛋白或特异性蛋白标志物。【关键词】胸腔积液;肺腺癌;肺鳞癌;双向电泳;蛋白质组肺癌是引起胸腔积液最常见的原因之一[1]。目前临床上主要采用胸水脱落细胞以及实验室生化检查等方法来鉴别胸腔积液的原因。利用双向电泳分离蛋白质，能够从大量蛋白质中直接筛选出特异蛋白质，为很多疾

3、病的发病机制研究和临床诊断提供依据[2-3]。本研究利用双向凝胶电泳技术分析肺腺癌与肺鳞癌胸水的蛋白质组，试图为寻找不同类型肺癌相关蛋白或特异性蛋白标志物打下基础，为肿瘤的诊断、分型、药物研究带来新的思路和途径。　　1材料和方法　　1.1主要试剂和仪器丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、超纯尿素(ultraurea)、硫脲(thiourea)、3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰氨、固相pH干胶条(17cm，pH4～7)，Bi

4、o-lytepH3～10，2-Dcleanup试剂盒等(Bio-Rad公司);蛋白酶抑制剂混合液protaseinhibitorcocktail(Sigma公司)，所有溶液均用MilliQ水配制。　　PROTEANIEFCELL等电聚焦仪，PROTEANⅡXi垂直板电泳仪及其附件，GS-800扫描成像系统，PDQuest凝胶图像分析软件(Bio-Rad公司)，UV2800紫外可见分光光度计(上海尤尼柯公司)。　　1.2标本温州医学院附属第一医院2007年11月-2008年6月门诊及住院患者20例

5、，年龄32～78岁。肺腺癌伴胸腔积液12例，肺鳞癌伴胸腔积液8例，所有病例均经支气管镜组织活检和刷取涂片细胞学检查所确诊。　　1.3实验方法　　1.3.1标本制备：每例胸腔积液标本各取10mL，同组标本混合后4℃，4000r/min离心10min，取上清液。所有标本按照1:4(V/V)比例加入10%TCA-丙酮溶液，混匀后于-20℃放置过夜，4℃，14000r/min，离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮，4℃，14000×g，离心5min，洗2次，弃上清，沉淀用裂解液(8mol/L尿素，4

6、%CHAPS，50mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte)重悬后用Bradford法[4]测蛋白质浓度，-80℃冰箱保存备用。　　1.3.2双向凝胶电泳：参考文献[5]方法，根据样品情况适当改进。第一向——固相pH梯度等电聚焦凝胶电泳，采用低电压胶内泡胀法，将200μg蛋白样品与上样缓冲液(8mol/L尿素，2%CHAPS，50mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte，0.001%溴酚蓝)共300μL混合后加入聚焦盘中，选用pH4～7线性17cm胶条，IPG胶条胶面朝下放入水化液，加盖

7、3mL矿物油。聚焦参数见表1。等电聚焦后的IPG胶条依次在含1%DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液(6mol/L尿素，2%SDS，50mmol/LTris-HClpH8.8，20%甘油)中各平衡15min，转移至8%～16%线性梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封顶。　　第二向——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：以恒流10mA/gel电泳15min，再加大电流至30mA/gel直至溴酚蓝达到胶的底端。按照文献[6]方法进行高灵敏度的银染。　　1.3.3凝胶图像的采集和分析

8、：凝胶用GS-800图像扫描仪透射扫描，分辨率为：63.5×63.5microns。图像配比分析采用PDQuest7.4.0进行详细分析、比较蛋白质点差异。　　2结果　　2.1肺腺癌胸腔积液组和肺鳞癌胸腔积液蛋白质双向电泳图谱的建立在相同条件下，同组实验重复3次。用PDQuest软件分析，其中肺腺癌胸腔积液蛋白质点平均(376±17)个，同组匹配率为88.3%;肺鳞癌胸腔积液蛋白质点平均(383±21)个，同组匹配率为86%。蛋白质双向电泳图谱(见图1)，从左到右等电点增加，从下往上分子质量增加