运用2d-lc-msms结合itraq技术筛选人肺腺癌质膜蛋白质标志物

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1、分类号UDC博士学位论文密级运用2D—LC．MS／MS结合iTRAQ技术筛选人肺腺癌质膜蛋白质标志物ScreeningofPlasmaMembraneProteinBiomarkersofHumanLungAdenocarcinomausing2D--LC-—MS／MSCombinedwithiTRAQTechnologies作者姓名：张鹏飞学科专业：病理学与病理生理学学院(系、所)：湘雅医院指导教师：肖志强教授论文答辩日期型≥、Jz。答辩委员会主席涎皇!墅}>中南大学二0一二年十月原创性声明本人声明，所呈交的学位

2、论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：歪塑塑垒乡日期：丝!三年旦月』日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采

3、用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：冶坐导师签名：日期：坐年上月土日博士学位论文中文摘要摘要肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位，且其发病率将在相当长时期内呈显著上升趋势。按照组织学分类，肺癌一般分成鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌四种类型，其中肺腺癌(1ungadenocarcinoma)约占全部肺癌的20--30％。近年来，肺腺癌的发病率呈逐步上升，且患者预

4、后差、死亡率高，其5年生存率不超过16％。究其原因，主要是因为肺腺癌发病隐匿，早期症状不明显，多数患者首次就诊时就己发生肿瘤转移，失去了最佳治疗时机。即使手术后，多数患者仍会死于肺腺癌复发或远处转移。所以，肺腺癌早期诊断和复发转移预测对于肺腺癌防治具有重要作用。理论上，标志物(biomarkers)是肿瘤诊断和病情监测最敏感的指标。因此，寻找新的肺腺癌标志物，是提高肿瘤患者治愈率与生存率的有效手段，并对于肺腺癌的诊断和治疗具有重要意义。为筛选肺腺癌标志物，本研究利用临床诊断选取肺腺癌组织和癌旁正常肺组织为研究对象，

5、首先采用差速离心、蔗糖密度梯度离一C,(sucrosedensitycentrifugation)联合双水相法(aqueoustwo-phasepartition)纯化组织细胞质膜，然后运用同位素标记相对和绝对定量(isobarictagforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)标记技术结合二维液相色谱(twodimensionalliquidchromatography,2D—LC)一串联质谱(tandemMass本课题受如下基金资助：国家973计划课题(2013cB910

6、502)，国家自然科学基金重点项目(81230053)，“重大新药创制”国家科技重大专项(2012zx093030．006)，国家自然科学基金(30973290，81272609，81172559)，芙蓉学者特聘教授计划(湘教通[20071362号)，湖南省科技重点科研项目(2010FJ2009)，湖南省自然科学基金f11JJ2045)。博士学位论文中文摘要Spectrometry,MS／MS)分离鉴定肺腺癌组织和癌旁正常肺组织的差异质膜蛋白质。再用蛋白质印记(westernblot)验证部分差异质膜蛋白质FLOT

7、1(Flotillin-1)，CAV1(Caveolin一1)和ITGB1(Integrin131)在肺腺癌组织和癌旁正常肺组织的表达情况，最后运用免疫组织化学(immuno．histochemistry)染色检测FLOTl，CAVl和ITGBl三个差异质膜蛋白质在存挡的石蜡包埋肺腺癌组织中的表达，统计学分析FLOTl，CAVl和ITGBl的表达水平与肺腺癌临床病理因素及患者复发和预后的关系。本研究不仅建立了一种差速离心、蔗糖密度梯度离心结合双水相纯化肺腺癌组织质膜的方法，而且发展了一个有利质膜蛋白质分离鉴定的iT

8、RAQ一2DLC．MS／MS研究策略。41个差异蛋白质(含36个差异质膜蛋白)得到准确鉴定，与癌旁正常肺组织相比，18个蛋白质在肺腺癌组织中表达上调，23个蛋白质在肺腺癌组织中表达下调。Westernblot验证结果显示：FLOTl和ITGBl在肺腺癌组织中较癌旁正常肺组织中表达升高，CAVl在肺腺癌组织中较癌旁正常肺组织中表达降低。免疫组织化学染色进一步证