肺腺癌肿瘤标志物初步筛选及鉴定

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1、河南大学硕士学位论文肺腺癌肿瘤标志物初步筛选及鉴定姓名：孙明飞申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：张双林201205摘要1、背景与目的肺癌是呼吸系统最为常见的恶性肿瘤，绝大多数为支气管粘膜上皮恶变形成，故可以称为支气管肺癌。肺癌的病理类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的80％以上，又可分为腺癌，鳞癌，大细胞癌，鳞腺癌等几种类型。近年来肺腺癌发病率在迅速增长，发病年龄也趋向年轻化，以女性多见。因肺腺癌细胞的生物学特性与其他恶性肿瘤基本一致，既可向支气管腔内、临近肺组织及其它器官浸润生长。亦可通过淋巴、血行等途径转移扩散，所以大部分患

2、者发现时已为晚期，失去了手术机会，远期生存率较低。肺腺癌的传统治疗方法为手术、化疗、放疗相结合的综合治疗，但并没有有效地提高总的五年生存率。临床研究表明：被诊断出的早期肺腺癌，进行以手术为主结合放化疗的治疗，其五年生存率可高达90％。而已经发生转移的肺腺癌，因不能进行手术治疗，其生存率大大降低。目前临床中肺腺癌主要的诊断方法有影像学、实验室生化检查、病理学等手段，但仍然有很大一部肺腺癌患者不能被早期确诊。因此，寻找肺腺癌特异性肿瘤标志物，提高其早期诊断率是目前亟待解决的关键问题。本研究联合双向凝胶电泳技术和质谱技术建立了肺腺癌组织及配对癌旁组织的2-DE图谱，并对两

3、者蛋白质表达的差异进行分析，进而寻找有诊断价值的相关蛋白。2、方法首先，刮取手术切除后新鲜的肺腺癌组织及距肿瘤5cm以上的癌旁组织18例。刮取时尽可能的去除可辨别的问质成分，以得到较纯净的肿瘤细胞和癌旁肺组织细胞。在低温状态下，将取得的标本用无菌生理盐水反复冲洗，以去除血液成分，处理后的样品置于一80℃冰箱保存。并在低温下裂解组织标本，匀浆，离心后取上清得组织总蛋白。其次，应用双向凝胶电泳(2-DE)对肺腺癌组织、配对癌旁组织进行蛋白质组学比较研究，获得两者的双向凝胶电泳图谱后，经过ImageMaster2DPlatiRum5．0软件对双向凝胶电泳图谱进行分析，找到

4、肺腺癌组织及配对癌旁组织具有最著差异的蛋白点。挖取部分冠著差异的蛋白点后经酶解，将所得肽段经基质辅助激光解析电离飞行时I'HJ质谱仪(MALDI—TOF—TOF—MS)检测，按照检测结果查询蛋白数据库，最终确定蛋白种类。3、结果(1)获得了分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳银染图谱，每块双向凝胶电泳银染图谱的平均蛋白点数分别为1232±56和1158±71；(2)ImageMaster2DPlatinum5．0软件对图谱分析后，获得差异大于3倍的蛋白点63个，其中12个点仅在肺腺癌组织中高表达，5个点仅在配对癌旁组织中高表达；(3)我们选取仅在肺腺癌组织高表达的12个

5、蛋白质点，并通过MALDI—TOF—TOF—MS质谱鉴定，其中11个蛋白点被成功鉴定。除去冗余，实际只鉴定出5种蛋白质，并获得肽质量指纹图谱。这5种蛋白分别为：23KD-白蛋白、S100钙结合蛋白(S100-A11)、Ras相关蛋白Rab-14、微管辅助蛋白(Stathmin)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)。4、结论本实验结果结合文献报道，排除实验系统误差和个体差异因素外，其中23KD一白蛋白是未能完全去除组织标本的血液成分所致。凝溶胶蛋白(钙结合微管蛋白、Gelsolin)、S100钙结合蛋白(S100一A11)、Ras相关蛋白Rab一14(Ras—relate

6、dproteinRab一14)、微管辅助蛋白(Stathmin)，这4种蛋白均有肿瘤相关性。它们均在细胞的恶变过程中起到了相应的作用，其可能参与了肺腺癌细胞的侵袭转移、信号调节、分化、增殖、分泌、周期活动等。这4种差异蛋白可作为肺腺癌的候选肿瘤标志物，也为筛选肺腺癌的早期诊断、治疗及预后评估的肿瘤标志物奠定了基础。关键词：肺腺癌，蛋白质组学，双向凝胶电泳，肿瘤标志物，差异蛋白1Backgroundand0bjectiveAbstractLungcanceristhemostcommonmalignanttumorofbreathingsystem，andthemaj

7、orityofitisusuallybronchialepitheliumevildeformation．Itcouldbecalledbronchiallungcancer．Thepathologicaltypeoflungcancerincludesmallcelllungcancerandnon··smallcelllungcancer,andthenon··smallcelllungcanceraccountsformorethan80％，whichCallbedividedintoseveraltypesofadenocarcinoma,squamou