人lif及osm转基因细胞建立及其对脐血cd34-%27%2b-造血干%2f祖细胞体外扩增作用的研究

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1、人LIF及OsM转基因细胞的建立及其对脐血cD34+造血干，祖细胞体外扩增作用的研究中文摘要人LIF及OSM转基因细胞的建立及其对脐血CD34+造血干／祖细胞体外扩增作用的研究q}文摘要目的：构建稳定表达人白血病抑制因子(1eukemiaiIlllibitoryfactor'LIF)及人抑瘤素M(oncostatinM．OsM)基因的人胚胎成纤维细胞，将其作为饲养层细胞，研究其对脐带血CD34+造血干／祖细胞(hem砷DpoieticsteIn／proge疵orcells，HSPC)体外扩增的支持作用。方法：将本科

2、室构建和保存的人LIF和0SM基因真核表达载体pcDNA3．O．11LIF和pcDNA3．1(．)_hosM经鉴定后采用脂质体转染法分别转入wI．38人胚肺成纤维细胞系中进行表达，通过氨基糖苷类抗生素类似物(珥18筛选出能够稳定表达目的基因hLIF和h0SM的单细胞克隆。同时尝试构建这两个基因的重组逆转录病毒载体，用逆转录病毒载体介导基因的转移，经zeocin筛选后获得基因修饰的人胚胎成纤维细胞株。采用分子生物学(RT_PcR法)和免瘴学(ELIsA法)的方法分别从mI矾A水平和蛋白质水平检测目的基因能否在人胚胎成

3、纤维细胞中成功转录和翻译，同时检测真核细胞表达上清中的细胞因子hLIF及h0SM对靶细胞的生物学活性。然后将构建成功的转基因人胚胎成纤维细胞经过丝裂霉素(MMc)处理后作为饲养层细胞，与采用免疫磁珠法新鲜分离出来的脐带血cD34+HsPc共培养7天，检测体外培养前后脐带血cD34+细胞数量和细胞表面标志CD34、CD31、CD62L、CD49d、CD54、趋化因子受体CXCR4等的表达，观察转hLIF及hosM基因的人胚胎成纤维细胞对脐血cD34+HsPc体外扩增的影响。实验中以空质粒载体组作为对照组。结果：PcR

4、(聚合酶链式反应)和测序结果表明由本科室构建的真核表达重组质粒pcDNA3．O_huF和pcDNA3．1(一)．hOsM是正确的。PcR、限制性内切酶双酶切和测序结果证明重组逆转录病毒载体pEG刀MCS—HA-hUF和pEGZ，MCS．HA-hOSM构建成人LIF及OsM转基因细胞的建立及其对脐血cD34+造血千衄细胞体外扩增作用的研究中文摘要功。RT-PcR结果分别有约609bp和750bp特定条带，说明脂质体介导的人LIF和OSM基因可以在人胚肺成纤维细胞wI．38中转录；ELISA结果测定表达产物的浓度分别为

5、LIF：11．105p∥ml，OSM：49．547pg，ml；同法鉴定逆转录病毒介导的人LIF和0SM基因可以在人胚肾成纤维细胞293T中表达，且转基因293T细胞上清中细胞因子含量比转基因wI一38细胞上清多，分别为LIF：110．134pg／ml，OSM：159．987pg／ml；表达产物具有相应的天然的生物学活性，能够分别抑制人白血病细胞HL60和人黑色素瘤细胞A375的生长。采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+HsPC，CD34+细胞纯度可达90％以上，产率约为45％，表面分子阳性率分别约为CD3189．33

6、％，CD62L23．60％，CD49d85．4％，CD5474．9％，CxCR476．6％，共培养7天后，再次测定，CD34+细胞比例均有不同程度的降低。结果显示：培养液中添加细胞因子hOSM组的CD34+细胞比例相比未添加组高，细胞因子联合饲养层组相比单纯细胞因子组高，转OSM、LIF基因的饲养层组相比未转基因组高。研究还发现，细胞因子hOSM还可减缓脐带血CD34+细胞cxcR4表达的下降程度，提示0SM有助于保持脐血造血细胞的归巢能力。结论：本研究建立了两种hLIF、hosM基因真核稳定表达细胞株，表达产物具

7、有相应的生物学活性；成功构建了重组逆转录病毒载体pEGZ／：MCS．HA．hLIF和pEG刀McS—HA-hosM；采用免疫磁珠法分离、富集到脐带血cD34+HsPc，纯度可达90％以上；实验结果初步显示经hLIF和hOsM基因修饰的转基因人胚胎成纤维细胞可改善脐血造血细胞体外培养的微环境，有助于维持其多能性和未分化状态。关键词：人白血病抑制因子；人抑瘤素M；真核表达；饲养层；造血于，祖细胞Ⅱ作者：苗莉指导教师：缪竞诚杨吉成人LIF及OsM转基因细胞的建立及其对脐血cD34+造血干，祖细胞体外扩增作用的研究英文摘要

8、EstablishmentofTransgenicCellStrainsExpressinghLIFandhoSMGeneandTheirRolesinProlif．erationofUmbilicalCordBloodCD34+HSPCinv“roAbstract0bjec6Ve：Tbconstnlcth啪aIl锄bryofibroblastscells仃