无血清两步法脐血巨核祖细胞体外扩增及诱导成熟的研究-

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1、无血清两步法脐血巨核祖细胞体外扩增及诱导成熟的研究*作者：莫文健，毛平，李庆山，何秋山，应逸，朱志刚，许艳丽【摘要】目的建立一种新的脐血无血清培养两步法，通过脐血单个核细胞体外培养获得大量的巨核细胞，为临床研究提供平台。方法首先将脐血单个核细胞在无血清培养液中加入TPO、SCF、IL-6、IL-3培养至14天行巨核祖细胞体外扩增，然后单纯加入TPO、IL-6再培养4天诱导巨核细胞成熟，在0、6、10、14、18天分别进行单个核细胞（MNC）数、CFU-MK、CD41＋细胞的检测，第18天进行形态学检测。结果CFU-MK

2、于培养第10天最高，扩增了6.8倍。MNC、CD41+细胞数于第18天最高，MNC数扩增了4.8倍，CD41+细胞扩增了44倍。在第18天，有核细胞形态学分析50%～74%为巨核细胞，巨核细胞中94%～96%为颗粒及产板型巨核细胞。结论在体外，使用这种新的两步培养法可获取大量的脐血来源的巨核细胞以供研究使用。【关键词】脐血；单个核细胞；无血清培养；巨核细胞；成熟【Abstract】ObjectiveDevelopmentaneethodtogetmanyCB-derivedmegakaryocytesfromcordb

3、loodmononuclearcells(MNCs)forclinicalresearch.MethodsFirst，cordbloodMNC-freemediumbyatbersofMNCs，CFU-MKsandCD41+cellseasuredatday0，6，10，14and18.Morphology　analysisepointofmaximalCFU-MK，MNC，CD41+cellsnumberisatday10，18and18.ThenumberofCFU-MK，MNC，CD41+cellsexpande

4、d6.8，4.8and44foldrespectively.Atday18，50%～74%maturemegakaryocytescanbeidentifiedbymorphologyinthenucleatedcells.94%～96%ofthemegakaryocytesaregranularmegakaryocytesandthrombocytogenousmegakaryocytes.ConclusionInvitro，egakaryoctesderivedfromcordbloodintheneethod.【

5、Keybilicalcordblood；mononuclearcell；serum-freeculture；megakaryocyte；mature脐血造血干细胞移植后血小板恢复时间延迟是困扰临床的一大难题，大量研究表明，这主要与脐血中巨核祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟障碍有关［1］。其中，脐血巨核细胞为何会出现分化成熟障碍已成为目前研究的热点之一。而大量的脐血巨核细胞为进一步研究所必需，笔者为体外获取大量的脐血巨核细胞建立了一个新的较简便、有效的培养方法，为进一步研究提供了平台。在国内未见相关报道。现报道如下。

6、1材料与方法1.1研究对象以从足月正常分娩的健康产妇脐静脉采集的脐血MNC为研究对象，脐血由广州医学院附属广州市第一人民医院妇产科提供。1.2主要试剂HES（含6%羟乙基淀粉的0.9%氯化钠注射液）购自美国B.Braun公司。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液研究所。TPO、IL-3、SCF、IL-6均购自英国PeproTech公司。无血清培养液使用StemSpanTM　SFEM，巨核系祖细胞集落（CFU-MK）培养及鉴定体系使用MegaCultTM-C试剂盒，均购自加拿大StemCellTechnologies公司

7、。1.3MNC的分离采集足月妊娠的健康产妇脐血，以肝素抗凝（20u/ml），脐血采集量40～60ml，共采集6例，采集后2h内进行分离处理。以淋巴细胞分离液分离MNC后，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次。按1×107/ml细胞浓度加入无血清培养液StemSpan，在5%CO2、37℃及饱和湿度条件下在6孔培养板中孵育2h，以去除粘附细胞及残余血小板。孵育后，取出去粘附后MNC，用PBS100g洗涤1次后备用。1.4细胞的培养接种将去粘附后MNC按1×106/ml接种于无血清培养液StemSpan中，在StemSpan中

8、加入青霉素（100u/ml）、链霉素（100μg/ml）及细胞因子。按细胞因子组合的不同分组如下：阴性对照组、细胞因子组。细胞因子终浓度为：TPO50ng/ml，IL-320ng/ml，SCF50ng/ml，IL-620ng/ml。培养体系接种于50ml培养瓶中，每瓶液体总量为6ml，在5%CO2、37℃及饱和湿度条件下培养18天